高粱愈伤组织培养研究

郭晓丽

（衡水学院生命科学系 河北 衡水 053000）

高粱，属禾本科高粱属，是一种抗逆能力较强的作物，具有产量高、低耗水、耐盐碱等优良特性[1]。同时，还可广泛应用于工业开发加工领域，如工业发酵、生物能源等方面，具有举足轻重的地位[2]。与其他植物相比，高粱通过组织培养获得再生植株相对更难。高粱组织培养开始于30年前，但是通过幼胚培养获得植株还是20世纪80年代的事。依据以往的研究成果，不同基因型高粱愈伤组织的诱导率存在差异，且亲本与其杂交种的诱导率有一定的相关性[3]。不同外植体的诱导率差异较大，其中幼穗诱导率最高，花药诱导率最低，继代和幼苗分化都较难[4,5]。本研究以不同高粱品种的成熟种子和成熟胚为材料，以MS为基本培养基，添加不同浓度的2,4-D，以期获得状态较好的愈伤组织，为进一步获得再生植株及进行转基因研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料。供试的两个高粱品种河农16和CJK1，由中科院遗传所提供。

1.2 方法

1.2.1 愈伤组织诱导培养基配制。愈伤组织诱导培养基以MS为基本培养基，添加适量的脯氨酸、水解酪蛋白、谷氨酰氨和蔗糖。其中6-BA 0.5 mg/L、2,4-D分别为2 mg/L、3 mg/L、4 m g/L。将配制好的培养液pH值调节到5.8备用。

1.2.2 高粱种子的消毒。成熟种子依次用70%乙醇消毒30 s，0.1%升汞浸泡15 min，无菌水冲洗3～5次，接种于诱导培养基中。

1.2.3 种胚的剥取。将成熟种子表面消毒后浸泡12 h，无菌操作取出成熟胚，接入诱导培养基中。置于25±1℃暗培养。几天后种胚膨大并产生愈伤组织。

1.2.4 统计分析。接种后统计不同品种不同激素浓度的接种数，待3周左右统计愈伤组织的块数，计算愈伤组织出愈率。

出愈率＝诱导具分化能力的愈伤组织个数/接种的外植体个数×100%

2 结果及分析

2.1 不同浓度2,4-D对高粱成熟种子愈伤组织出愈率的影响。培养基中添加不同浓度2,4-D对不同高粱种子出愈率有一定影响。由表1可以看出，品种河农16当2,4-D浓度为2 mg/L时，出愈率达到最高，为89%；而当浓度为4 mg/L时，其出愈率最低，为76%，其出愈率随着2,4-D浓度的升高而降低。品种CKJ1当2,4-D浓度为3 mg/L时，其成熟种子出愈率达到最高，为87%；2,4-D浓度为4 mg/L时出愈率最低，为81%。由此可知，2,4-D最适浓度在3 mg/L左右，出愈率随2,4-D浓度的升高而呈现出先上升后下降的趋势。

表1 不同浓度2，4-D对成熟种子愈伤组织出愈率的影响

2.2 不同浓度2,4-D对高粱成熟胚愈伤组织出愈率的影响。由表2可知，品种河农16成熟胚在2,4-D浓度为4 mg/L时，出愈率达到最高，为99%，当2,4-D浓度为3 mg/L时，出愈率最低，为93%，但随着2,4-D浓度的继续降低，出愈率又出现上升。对于品种CKJ1来说，当2,4-D浓度为2 mg/L时，出愈率最高，为99%，随着2,4-D浓度的升高，其出愈率呈现先降低后升高的趋势。

表2 不同浓度2，4-D对高粱成熟胚愈伤组织出愈率的影响

3 小结

3.1 激素2,4-D对同一品种不同部位愈伤组织的影响。对于高粱品种河农16，接种胚时，其出愈率随着2,4-D浓度的升高呈现出先降低后升高的趋势；接种种子时，其出愈率随着2,4-D浓度的升高呈现出逐步下降的趋势。而高粱品种CKJ1，接种胚时，其出愈率随着2,4-D浓度的升高呈现出先降低后升高的趋势；接种种子时，其出愈率随着2,4-D浓度的升高呈现出先升高后降低的趋势。二者对2,4-D浓度的需求有非常大的差异，在接种胚的出愈率高的情况下，接种种子的出愈率就非常低。由以上结果可以看出，高粱愈伤组织的出愈率与所选用的部位有关。

3.2 激素2,4-D对不同品种的相同部位愈伤组织的影响。当同时接种胚时，对于品种河农16和CKJ1来讲，出愈率均随着2,4-D浓度的升高呈现出先降低后升高的趋势。当接种种子时，品种河农16出愈率随着2,4-D浓度的升高呈现出逐步下降的趋势，品种CKJ1出愈率随着2,4-D浓度的升高呈现出先升高后降低的趋势。二者对于2,4-D浓度的需求有较大的差异，品种CKJ1的最适2,4-D浓度略高于品种河农16。由以上结果可以看出，高粱愈伤组织的出愈率与所选用的高粱品种有关，即与高粱的基因型有关。

4 讨论

影响愈伤组织形成的因素包括材料的基因型、基本培养基、激素配比、培养基附加成分、外植体发育程度和生理状态等，这些因素协调配合才能构成诱导愈伤组织的决定条件。一般认为，愈伤组织的发生率与品种的基因型密切相关，有些品种有很高的诱导率，有些却很难诱导出愈伤组织。本研究中我们发现，不同品种的高粱在相同的激素浓度下均表现出不同的出愈率，表明基因型对品种的再生起到很关键的作用[6]。

此外，在植物的组织培养过程中，添加适当的植物激素是成功诱导愈伤组织的关键因素[7]。本研究发现，在含有不同浓度2,4-D的培养基中，不论是高粱成熟种子还是成熟胚，均可获得一定的愈伤组织，但是随浓度的改变均可不同程度影响愈伤组织的出愈率。

组织培养中，分化能力不强的愈伤组织容易出现褐化现象。引起褐变的原因有很多，在禾本科植物体的体细胞中含有很多酚类化合物，酚类化合物与多酚氧化酶分隔存在，此时比较稳定。酚类经氧化后转化为醌类物质最终导致愈伤组织死亡。可采用不同方法降低愈伤组织的褐化现象[8]。