江西省2005-2015年脑膜炎奈瑟菌血清分型和分子分型分析

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脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis，Nm)是引起流行性脑脊髓膜炎(简称流脑)的病原体，分为12个血清群，其中A、B、C、W135和Y群引起了95%以上的流脑病例[1-2]。上世纪50年代至80年代末，我国发生过3次流脑全国大流行，均是由A群引起，B群和C群只引起散发病例。80年代末由于A群流脑疫苗的使用，我国流脑发病率显著下降。2003年在安徽省发生由ST-4821序列型C群菌株引起的流脑流行[3]，之后在全国20多个省份均出现了ST-4821型C群菌株引起的流脑病例[4]，江西省也发生多起C群流脑暴发事件和多个散发病例[5]。2005年，全国常规免疫的流脑疫苗由A群疫苗改为A+C群疫苗。

本研究拟采用血清分型、脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE)和多位点序列分型(Multilocus Sequence Typing，MLST)技术，对江西省2005-2015年分离的脑膜炎奈瑟菌进行分析，旨在探讨人群普遍接种A+C群流脑疫苗之后，江西省脑膜炎奈瑟菌的血清型和分子型别变化特征，了解江西省脑膜炎奈瑟菌的菌群变迁情况，为流脑的预防控制提供依据。

1 材料与方法

1.1菌株来源 200株脑膜炎奈瑟菌为本实验室保存的于2005-2015年在江西省分离的菌株，其中临床病人分离株15株、密切接触者分离株57株、健康人群分离株128株。菌株详细信息见表1。

1.2试剂及仪器 血平板或巧克力平板(广州迪景公司，中国)，API NH生化鉴定试剂盒(梅里埃公司，法国)，诊断血清(BD公司，美国)，细菌基因组DNA提取试剂盒(QIAGEN公司，德国)。脑膜炎奈瑟菌MLST分型引物由大连宝生物公司合成。PCR扩增仪为PTC200(M J 公司，美国)，凝胶成像系统为GEL Doc2000(Bio-Rad公司，美国)。

表1 本研究分析的200株脑膜炎奈瑟菌分离时间和来源分布Tab.1 Isolation time and source distribution of 200 N.meningitidis strains analyzed in the study

1.3 方法

1.3.1冻干菌株的复苏和复核 所有脑膜炎奈瑟菌经过常规培养、涂片、生化、血清鉴定后冻干保存于-20 ℃。用营养肉汤溶解复苏菌株后接种于血平板或巧克力平板，37 ℃，5% CO2培养18～24 h，挑单个菌落纯培养后，再按常规方法进行复核鉴定。

1.3.2细菌基因组DNA的提取 按照试剂盒说明书严格操作，提取的基因组DNA放-20 ℃冰箱保存待用。

1.3.3PFGE实验和数据分析 参考之前的方法[3]， 主要参数是：用bioMérieux DENSIMAT比浊仪调整细菌悬液浊度为3.8-4.0；使用NheI作为限制性内切酶；在CHEF-DRIII(Bio-Rad Laboratories，美国)电泳仪中进行脉冲场凝胶电泳；电泳参数为1～25 s，16 h。PFGE图像录入BioNumerics(Version5.1，Applied maths，Inc.)软件包进行处理和分析。图像之间的相似性系数用Dice系数(Dice coefficients，SD)表示[6]。出现不同条带即判定为不同的型别，对每一个型别都进行命名。根据每2个图像之间的相似性系数，用非加权配对算术平均法(unweighted pair group average method，UPGMA)进行聚类，构建聚类树。聚类分析时，条带位置差异容许度设置为1.5%。

1.3.4MLST 参照PubMLST(http:/pubmlst.org/neisseria)公布的标准方案，确定进行脑膜炎奈瑟菌 MLST的7个管家基因位点(abcZ、adk、aroE、fumC、gdh、pdhC、pgm)及引物。50 μL PCR反应体系；电泳参数为：94 ℃，3 min；94 ℃，1 min；64 ℃，1 min；72 ℃，1 min；33个循环；72 ℃，7 min。对PCR扩增产物进行测序，测序结果与PubMLST数据库(http:/pubmlst.org/neisseria)进行比对，获得各看家基因位点的等位基因数值，并形成相应的等位基因谱，判断其序列型(ST)。

2 结 果

2.1血清型分布特征 200株脑膜炎奈瑟菌中，有168株可用现有血清鉴定出血清群，为C群101株，B群50株，A群12株，W135群2株，Y群2株，X群1株。另外32株用现有血清无法鉴定出血清群，判定为不可分群菌株。

15株临床病人分离株均为C群。57株密切接触者分离株中，有49株(86.0%)为C群，4株为A群，3株为B群，1株不可分群。128株健康人群菌株有37株(28.9%)为C群，8株为A群，47株为B群，2株为W135群，2株为Y群，1株为X群，31株为不可分群菌株。W135群、X群、Y群菌株只在健康人群中分离到。临床病人和密切接触者中的C群菌株构成比高于健康人群(图1)。2005年、2007年、2008年、2012年分离的健康人群菌株相比其他年份较多，结果显示这4年的健康人群分离株的血清群构成情况差异较大，其中2005年和2012年以B群和不可分群菌株为主，C群菌株分别只占1.9%和0%；而2007年和2008年的健康人群菌株中C群占的比例比较大，分别为58.8%和81.5%(图2)。

图2 不同来源脑膜炎奈瑟菌的血清型分布Fig.2 Serogroup distribution of N.meningitidis isolated in different sources

图1 200株脑膜炎奈瑟菌按照不同来源和不同年份的血清群分布Fig.1 Serogroup distribution of N.meningitidis isolated in different sources and years

2.2C群菌株分子分型结果 我们对101株C群菌株进行PFGE实验，其中6株发生染色体降解未能获得可用的电泳图谱。另外95株分为14个PFGE型，分别命名为NMNh.JX0001- NMNh.JX0014型。其中NMNh.JX0001和NMNh.JX0002为优势带型，分别包含46和30株菌。NMNh.JX0001和NMNh.JX0002只存在1条条带的差异。有4个带型与优势带型只相差1～3条带，相似度大于85%，并且在聚类树上聚集成簇(图3中的簇1)。簇1由6个型别聚集而成，一共包含86株菌，占总菌株的90.5%(86/95)。其余8个带型分别只包含1-2株菌，与优势型别差异条带数多于9条，相似度低于65%。

图3 对95株C群脑膜炎奈瑟菌进行PFGE分型获得的14种带型的聚类图Fig.3 Cluster of 14 PFGE patterns obtained from 95 serogroup C Neisseria meningitidis

15株临床病人分离的C群菌株分为5种型别，其中5株属于NMNh.JX0001型，7株属于NMNh.JX0002型。49株密切接触者分离的C群菌株分为7种型别，其中34株属于NMNh.JX0001型，7株属于NMNh.JX0002型。31株健康人群C群菌株分为7种型别，其中7株属于NMNh.JX0001型、16株属于NMNh.JX0002型。

两个优势型别(NMNh.JX0001和NMNh.JX0002)主要分布在2005-2008年以及2013-2014年(图4)。NMNh.JX0001型菌株在2005-2006年、2007-2008年、2013-2014年3个时间段在C群菌株中所占比例分别为97.2%、28.6%、10.0%；而NMNh.JX0002型菌株在2005-2006年、2007-2008年、2013-2014年3个时间段在C群菌株中所占比例分别为2.8%、57.1%、90.0%。

图4 C群脑膜炎奈瑟菌聚类簇中6种带型的年份分布Fig.4 The year distribution of 6 PFGE patterns of serogroup C Neisseria meningitidis

挑选优势带型以及相似带型的33株菌株进行MLST分型，包括16株NMNh.JX0001型、9株NMNh.JX0002型、4株NMNh.JX0003型、1株NMNh.JX0004型、2株NMNh.JX0005型、1株NMNh.JX0006型菌株。结果显示所有33株菌均为ST-4821型。

3 讨 论

我国历史上曾发生过3次流脑全国大流行，均是由A群引起。自80年代末开始使用A群流脑疫苗后，我国流脑发病率显著下降，目前已经少有A群流脑病例报道。在本研究中，江西省2005-2015年从临床病人分离的15株脑膜炎奈瑟菌均为C群，提示江西省流脑病例目前以C群为主。本研究健康人群分离的脑膜炎奈瑟菌中，不同年份的C群菌株占比例差异很大。2005年健康人群分离的菌株中，C群只占1.9%，但是临床病人和密切接触者分离株几乎全部为C群。密切接触者均未出现临床症状，处于健康带菌状态，大部分密切接触者分离株的分子型别和病人菌株的分子型别一样，提示密切接触者带有致病克隆群，可能是传染源也可能是被病例传染的。与江西省相邻的安徽省在2004年发生ST-4821型C群流脑暴发流行。虽然无法考证临床病人和密切接触者是否有安徽旅行史，但是可以根据血清群和分子分型结果推测江西C群菌株可能由安徽传入。到2007年和2008年，健康人群分离株中C群占的比例上升至58.8%和81.5%，提示自2005年C群菌株传入江西以后，到2007-2008年C群菌株已经在健康人群中大量携带，但是由于已经开展C群流脑疫苗的常规免疫，人群尤其是婴幼儿童对C群流脑具有一定的免疫力，所以并未出现C群流脑病例增多的现象。在2012-2015年，病人和密切接触者分离株均为C群菌株，但是健康人群分离的24株菌株中，没有鉴定出C群菌株，可能是由于健康人群抽样调查时未能采集到携带C群菌株的人群标本。2012-2015年已经普遍接种C群流脑疫苗，但是仍然有C群流脑病例发生，提示应该加强C群流脑疫苗免疫和查漏补种，并且开展健康人群抗体水平检测，研究人群的免疫力水平。

自2003-2004年我国出现C群流脑病例暴发以来，已经在全国20多个省份发现C群流脑病例，并且C群菌株几乎都为ST-4821型[4]。在之前的研究中我们揭示了2008年之前江西省流行的C群菌株为ST-4821型[7]，本研究中揭示江西省2008年至今的流行菌株也是ST-4821型C群菌株，跟全国情况一致。通过查询比对国家脑膜炎奈瑟菌分子分型数据库，本研究中的PFGE型别NMNh.JX0001型和NMNh.JX0002型是全国C群菌株的流行菌型。本研究揭示了江西省2005-2015年，C群菌株发生了由NMNh.JX0001型向NMNh.JX0002型的转变，但是NMNh.JX0001型和NMNh.JX0002型菌株的分布时间跨度分别为2005-2014年和2006-2014年，提示可能长期存在着两种菌型的传播，其中NMNh.JX0001型菌株的比例在逐年降低，而NMNh.JX0002型菌株的比例在逐年升高。PFGE型别的变迁有可能导致新的流行模式，所以有必要开展持续监测，密切关注NMNh.JX0002型菌株在人群中的传播扩散以及引起的流脑病例。