乳腺癌内TNFR1的表达及与临床病理因素的相关性

李欣欣 张大伟 张静 周沾 杨雪娇 苏春阳 孙平

【摘要】 目的：检测乳腺癌组织内TNFR1的表达，并分析与临床病理因素的相关性。方法：选取2015年9月-2016年1月牡丹江肿瘤医院乳腺外科手术切除的30例乳腺癌标本为试验组，距离肿瘤边缘1 cm处的癌旁组织为对照组。应用Real-time PCR和免疫组织化学技术分别检测TNFR1 mRNA和蛋白的表达。结果：Real-time PCR检测显示，试验组TNFR1 mRNA的表达量为（0.07±0.03），高于对照组的（0.03±0.01），比较差异有统计学意义（P<0.05）；免疫组织化学染色显示，试验组TNFR1蛋白呈棕黄色，主要分布于细胞质内，呈弥漫性或局灶性分布，对照组TNFR1蛋白表达不明显；试验组TNFR1蛋白表达为（145.36±3.46），明显高于对照组的（119.69±14.28），比较差异有统计学意义（P<0.05）；乳腺癌内TNFR1蛋白的表达与患者年龄、肿瘤大小均无关（P>0.05），而与淋巴结转移及临床分期均密切相关（P<0.05）。结论：乳腺癌内TNFR1的表达可作为判断乳腺癌复发转移的重要标记物。

【关键词】 乳腺癌； TNFR1； 临床病理因素

【Abstract】 Objective：To detect TNFR1 expression in breast cancer tissues and analyze its correlation with clinicopathological factors.Method：A total of 30 breast cancer specimens from breast surgery in Mudanjiang Cancer Hospital from September 2015 to January 2016 were selected as experimental group，and the adjacent tissues 1 cm from the edge of the tumor as control group.TNFR1 mRNA and protein expression were detected by Real-time PCR and immunohistological staining respectively.Result：Real-time PCR detection showed that the expression of TNFR1 mRNA in experimental group was（0.07±0.03），which was higher than （0.03±0.01） in control group，the difference was statistically significant（P<0.05）.Immunohistochemical staining showed that the TNFR1 protein in experimental group was brown and yellow，mainly distributed in the cytoplasm，showing diffuse or focal distribution，and the expression of TNFR1 protein in control group was not obvious.The expression of TNFR1 protein in experimental group was（145.36±3.46），which was significantly higher than （119.69±14.28） in control group，the differences was statistically significant（P<0.05）.The expression of TNFR1 protein in breast cancer was not associated with age and tumor size（P>0.05），but was closely related to lymph node metastasis and clinical stage（P<0.05）.Conclusion：The expression of TNFR1 in breast cancer can be used as an important marker for the recurrence and metastasis of breast cancer.

【Key words】 Breast cancer； TNFR1； Clinicopathological factor

First-authors address：Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157011，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.24.009

腫瘤坏死因子受体1（Tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1）是分子量为55 kD的Ⅰ型跨膜受体，与肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）结合后可介导炎症、细胞增殖、凋亡等多种生物学效应[1-3]。TNFR1不仅存在于巨噬细胞、单核细胞等正常细胞表面，也存在于血液系统、消化系统等多种肿瘤细胞表面[4-6]，但乳腺癌内TNFR1的表达及临床意义尚不明确。本研究将采用Real-time PCR和免疫组织化学技术检测乳腺癌和癌旁组织内TNFR1 mRNA和蛋白质的表达，并从蛋白水平探讨TNFR1的表达与乳腺癌临床病理因素的相关性，为进一步明确乳腺癌的发生、发展机制提供依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年9月-2016年1月牡丹江肿瘤医院（笔者在该医院实习）乳腺外科手术切除的30例乳腺癌标本为试验组，另取距离肿瘤边缘1 cm处的癌旁组织为对照组。两组中每例标本各取两处分别放入液氮罐内冷冻用于Real-time PCR技术检测以及放入10%的福尔马林溶液内固定用于免疫组织化学染色。纳入标准：经临床病理诊断明确癌组织和癌旁组织成分。排除标准：显微镜下排除坏死组织。患者均为女性，平均年龄（55.00±10.34）岁；淋巴结转移18例，无淋巴结转移12例；根据WHO TNM分期标准，确定乳腺癌患者的临床分期；患者术前均未接受任何放、化疗治疗，术后病理证实均为乳腺癌；患者均对本研究知情同意，且本研究已经院伦理委员会审核批准。

1.2 主要试剂 鼠抗人TNFR1抗体购自美国Santa Cruz公司；Trizol试剂、RT-PCR试剂盒、2×SYBR Premix Ex Taq均购自美国Invitrogen公司；SABC免疫组化染色试剂盒、DAB均购自武汉博士德生物工程有限公司。PCR引物由上海博亚生物工程公司合成。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化SABC法 一抗TNFR1工作浓度（1︰800），DAB显色，染色步骤按试剂盒说明书进行。细胞膜或细胞质呈棕黄色染色为阳性。应用彩色病理图像分析系统测定随机选取的5个高倍视野内TNFR1蛋白的相对表达量，取平均值灰度值（Mean gray value，MGV）作为代表值。

1.3.2 Real-time PCR检测 按照试剂盒说明书操作，Trizol法分别提取乳腺癌组织和癌旁组织总RNA，RT-PCR逆转录cDNA，SYBR Premix Ex Taq试剂盒用于Real-time PCR定量检测。引物序列如下，TNFR1：5-GCCAGGAGAAACAGAACAC-3，（forward），5-CCGTTGGTAGCGATACATTA-3，（reverse）；U6作为内参序列为：5-GTGCTCGCTTCGGCAGCACAT-3，（forward） and 5-TACCTTGCGAAGTGCTTAAAC-3，（reverse）。每个样品重复三次，采用2-ΔΔCT法对TNFR1 mRNA表达进行统计学分析。

1.4 统计学处理 使用SPSS 15.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌组织内TNFR1 mRNA的表达 以GAPDH为内参，通过Real-time PCR检测30例乳腺癌组织和癌旁组织内TNFR1 mRNA的表达差异，按2-ΔΔCT量化分析试验组TNFR1 mRNA的表达量为（0.07±0.03），是对照组表达量（0.03±0.01）的2.34倍，比较差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2 乳腺癌组织内TNFR1蛋白的表达 光镜下观察乳腺癌内TNFR1蛋白免疫组化SABC染色呈棕黄色，主要分布于细胞质内，呈弥漫性或局灶性分布；癌旁组织TNFR1蛋白表达不明显（图1）；试验组TNFR1蛋白表达为（145.36±3.46），呈高表达，明显高于对照组的（119.69±14.28），比较差异有统计学意义（P<0.05）。

2.3 乳腺癌组织内TNFR1蛋白的表达与临床病理因素的关系 乳腺癌内TNFR1蛋白的表达与患者年龄、肿瘤大小均无关（P>0.05），而与淋巴结转移及临床分期密切均相关（P<0.05）。见表3。

3 讨论

乳腺癌是威胁女性健康的主要恶性肿瘤之一，淋巴结转移是多数患者死亡的主要原因，因此有效控制淋巴結转移对改善乳腺癌患者预后尤为重要[7-10]。

TNF-α最主要的生物学活性就是通过与TNFR1受体结合发挥抗肿瘤效应。大量研究证实肿瘤组织内TNFR1的表达与肿瘤进展、分化、转移等临床病理因素密切相关，可作为推断肿瘤预后的独立因素[11-15]。文献[16]采用免疫组化法检测胃癌组织、癌旁组织和正常胃黏膜内TNFR1的表达，结果证实胃癌组织内TNFR1的表达均比癌旁组织及正常黏膜显著增高，并且胃癌组织内TNFR1的表达与肿瘤分化程度有关。同样，Hosono等[17]、Takahashi等[18]对大肠癌的研究也显示TNFR1的表达与肿瘤的分化程度及分期有关，而与其他临床病理因素无关。而且研究发现，TNFR1表达与慢性髓性白血病的恶性程度也存在一定内在联系[19-20]。但关于乳腺癌内TNFR1的表达及临床意义的研究目前还未见详尽报道，因此检测乳腺癌组织内TNFR1的表达并分析与临床病理因素的相关性具有十分重要的意义。

本研究首先采用Real-time PCR和免疫组化技术分别从基因和蛋白水平检测了乳腺癌和癌旁组织内TNFR1的表达，结果发现乳腺癌内

TNFR1 mRNA和蛋白质的表达水平均明显高于癌旁组织（P<0.05），这意味着TNFR1在乳腺癌的发生和发展过程中发挥重要作用，高表达的TNFR1可能介导了TNF-α对肿瘤细胞的杀伤作用。接下来本研究进一步分析了乳腺癌内TNFR1蛋白表达水平与患者年龄、肿瘤大小、淋巴结转移及临床分期等病理因素的相关性，结果显示，乳腺癌内TNFR1的表达与患者年龄、肿瘤大小等因素均无关（P>0.05），而与淋巴结转移、临床分期密切均相关（P<0.05）。淋巴结未转移者TNFR1蛋白表达水平明显高于淋巴结转移者，表明TNFR1的表达高低可能与乳腺癌的恶性程度相关。肿瘤恶性程度越高，TNFR1表达水平越低，意味着肿瘤细胞越容易逃避TNF-α的毒性作用。同样，Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌患者TNFR1的表达水平明显高于Ⅲ、Ⅳ期，这进一步证明肿瘤形成初期机体就刺激肿瘤细胞表面表达更多的TNFR1，以抑制肿瘤的进展和转移。由此可见，检测TNFR1可作为预测乳腺癌淋巴结转移趋势的重要标记物。

綜上所述，TNFR1在乳腺癌内呈高表达，并可能在乳腺癌的发生及发展进程中发挥重要作用，可作为判断乳腺癌复发转移的重要标记物，但有关乳腺癌内TNFR1如何发挥作用的相关机制还有待进一步研究。

参考文献

[1] Chang S C，Yang W V.Hyperglycemia，tumorigenesis，and chronic inflammation[J].Crit Rev Oncol Hemotol，2016，108：146-153.

[2] Ham B，Fernandez M C，DCosta Z，et al.The diverse roles of the TNF axis in cancer progression and metastasis[J].Trends Cancer Res，2016，11（1）：1-27.

[3] Zhao Y，Yang F，Li W，et al.miR-29a suppresses MCF-7 cell growth by downregulating tumor necrosis factor receptor 1[J].Tumour Biol，2017，39（2）：1010428317692264.

[4] Oshima H.Role of inflammatory cytokine TNF-α and microenvironment in mouse gastric tumorigenesis[J].Nihon Yakurigaku Zasshi，2014，143（6）：279-282.

[5] Tian T，Wang M，Ma D.TNF-α，a good or bad factor in hematological diseases？[J].Stem Cell Investig，2014，1：12.

[6] Zekri A R N，Deeb S E，Bahnassy A A，et al.Role of relevant immune-modulators and cytokines in hepatocellular carcinoma and premalignant hepatic lesions[J].World J Gastroenterol，2018，24（11）：1228-1238.

[7] Yang M，Liu F，Higuchi K，et al.Serum amyloid A expression in the breast cancer tissue is associated with poor prognosis[J].Oncotarget，2016，7（24）：35843-35852.

[8] Bernier J，Rossier C，Horiot J C.Recent advances in regional treatment of breast carcinoma[J].Crit Rev Oncol Hematol，2016，99：107-114.

[9] Sohn G，Son B H，Lee S J，et al.Treatment and survival of patients with occult breast cancer with axillary lymph node metastasis：a nationwide retrospective study[J].J Surg Oncol，2014，110（3）：270-274.

[10] Kapoor N S，Shamonki J，Sim M S，et al.Impact of multifocality and lymph node metastasis on the prognosis and management of microvasive breast cancer[J].Ann Surg Oncol，2013，20（8）：2576-2581.

[11] Zhu G，Du Q，Wang X，et al.TNF-α promotes gallbladder cancer cell growth and invasion through autocrine mechanisms[J].Int J Mol Med，2014，33（6）：1431-1440.

[12] Tripsianis G，Papadopoulou E，Anagnostopoulos K，et al.

Coexpression of IL-6 and TNF-α： prognostic significance on breast cancer outcome[J].Neoplasma，2014，61（2）：205-212.

[13] Philipp S，Sosna J，Adam D.Cancer and necroptosis：friend or foe？[J].Cell Mol Life Sci，2016，73（11-12）：2183-2193.

[14] Yu M，Zhou X，Niu L，et al.Targeting transmembrane TNF-α suppresses breast cancer growth[J].Cancer Res，2013，73（13）：4061-4074.

[15] Minchenko O H，Tsymbal D O，Minchenko D O，et al.The role of the TNF receptors and apoptosis inducing ligands in tumor growth[J].Ukr Biochem J，2016，88（5）：18-37.

[16]高蕾，白岚，南清振，等.TNFR1在大肠癌中的表达及其意义[C]//中国中西医结合学会第十二次全国消化系统疾病学术研讨会论文汇编，2000.

[17] Hosono K，Yamada E，Endo H，et al.Increased tumor necrosis factor receptor 1 expression in human colorectal adenomas[J].World J Gastroenterol，2012，18（38）：5360-5368.

[18] Takahashi H，Hosono K，Endo H，et al.Colon epithelial proliferation and carcinogenesis in diet-induced obesity[J].

J Gastroenterol Hepatol，2013，28（Suppl 4）：41-47.

[19] Cisterne A，Baraz R，Khan N I，et al.Silence of death domains controls cell dealth through tumour necrosis factor-receptor 1 and caspase-10 in acute lymphoblastic leukemia[J].PLoS One，2014，9（7）：e103383.

[20] Baraz R，Cisterne A，Ssunders P O，et al.mTOR inhibition by everolimus in childhood acute lymphoblastic leukemia induces caspase-independent cell dealth[J].PLoS One，2014，9（7）：e102494.