小花山奈的组培快繁

刘勇劲 李冬梅 刘小飞 朱根发

摘要 以小花山柰无菌苗的芽基部为外植体，对芽基部进行继代增殖、丛生芽诱导以及生根培养基的筛选，建立了小花山柰无菌苗芽基部的组培快繁体系。结果表明：小花山奈无菌苗芽基部继代增殖比较合适的培养基为MS+6-BA8.0～10.0mg/L+NAA0～0.10mg/L+椰汁10%+白砂糖30g/L+卡拉胶粉10g/L，最佳的继代增殖培养基为MS+6-BA8.0mg/L+椰汁10%+白砂糖30g/L+卡拉胶粉10g/L;丛生芽诱导比较合适的培养基为MS+6-BA3.0～5.0mg/L+NAA0.05～0.10mg/L+椰汁10%+白砂糖30g/L+卡拉胶粉10g/L，最佳的丛生芽诱导培养基为MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.05mg/L+椰汁10%+白砂糖30g/L+卡拉胶粉10g/L;生根最佳的培养基为MS+NAA0.10mg/L+香蕉泥15%+活性炭1g/L+白沙糖30g/L+卡拉胶粉9.5g/L。

关键词 小花山奈;芽基部;增殖;芽诱导;生根

中图分类号 S682.36 文献标识码 A

小花山奈（Kaempferia parviflora）属于姜科（Zingiberaceae）山奈属（Kaempferia）植物，株高约30cm，叶丛生，叶片椭圆形，叶面绿色，叶缘红色，叶背具暗红色斑纹;花序包藏于一钟状总苞内，花多数较小，依次开放，花白色，唇瓣具紫红色斑纹;花期5～10月;根茎块状，药用;观叶类，株形好，叶漂亮可赏，可作为室内观叶和林下地被植物[1-2]。小花山奈不结果，故不能进行播种繁殖;其也没有茎杆，也不能用茎杆扦插繁殖;其根茎块状，也不能用带叶根茎扦插[1-4]。因此，只能采用切分根茎和组织培养的方法繁殖。由于母本量不足，切分根茎分株繁殖速度慢，而且对母株损伤大，短期内得不到大量种苗。

选用姜科山奈（Kaempferia galanga）块茎上刚萌发的芽为外植体时，用75%酒精消毒1min，无菌水漂洗1次，0.1%升汞消毒10min，无菌水漂洗2次，0.1%升汞消毒6min的消毒效果最好，存活率56.66%，污染率6.67%，但外植体存活数天后，有细菌污染现象，这可能是山奈自身带有内生菌所致，导致外植体灭菌困难[5]。由于山奈属植物的多样性和块茎自身带有内生菌，故采用常规组织培养的消毒程序灭菌困难。山奈块茎刚萌发的芽为外植体时，适宜的诱导培养基为MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.10mg/L，芽的萌发率100%，分化率146.67%[5].笔者前期研究发现，取小花山奈块茎上萌发的芽基部为外植体时，接种至诱导培养基MS+6-BA3.0-5.0mg/L+NAA0.10mg/L+椰汁10%+蔗糖20g/L+卡拉胶粉9.5g/L，接种60d后，芽的诱导率为0。目前，尚未有对小花山奈进行组织培养种苗生产的报道。因此，需尽快研发出一种有效的小花山奈组培快繁方法。

1 材料与方法

1.1 材料

采集小花山奈的根茎用自来水清洗干净（图1-A），剪掉根茎上的须根后，消毒后晾干;再放人洗净消毒的河沙中，恒温发芽（图1-B）;洗净根茎芽，取其芽基部。将消毒好的芽基部接种到增殖培养基（MS、6-BA8.0mg/L、NAA0.10mg/L、椰汁10%、蔗糖30g/L、卡拉胶粉9.5g/L）上培养（图1-C），直至芽基部形成球状（图1-D），然后切割增殖的芽基部接种丛生芽诱导培养基（MS、6-BA5.0mg/L、NAA0.10mg/L、椰汁10%、蔗糖30g/L、卡拉胶粉9.5g/L）诱导出丛生芽（图1-E）。取无菌苗的芽基部为材料。

1.2 方法

1.2.1 接种材料处理

在超净工作台上，将无菌苗从瓶中取出，置于消毒的碟子中，用刀片切去叶片、茎和根，只留约1cm的芽基部。每一个芽基部大小接近，接种于芽基部增殖培养中。

1.2.2 试验配方 芽基部增殖培养。试验了6种芽基部增殖培养基A1～A6，基本成分为MS、白沙糖 30g/L和卡拉胶粉10g/L，pH5.8～6.0，其它成分见表1。培养基灭菌条件125℃，40min，下同。每种增殖培养基接40瓶，每瓶接1个芽基部。20d后观测芽基部增大倍数、启动率、出芽数和污染率。启动率/%=（启动的芽基部数/接种的芽基部总数）×100%;出芽数=总芽数/接种总芽基部数;污染率/%=（污染芽基部数/接种总芽基部数）×100%。

丛生芽诱导培养。试验了6种丛生芽诱导培养基B1～B6，基本成分为MS、白沙糖30g/L和卡拉胶粉10g/L，pH5.8～6.0，其它成分见表1。每种接40瓶，每瓶接1个芽基部。50d后观测启动率、出芽数以及污染率。启动率/%=（启动的芽基部数/接种的芽基部总数）×100%;出芽数一总芽数/接种时总芽基部数;污染率/%=（污染芽基部数/接种总芽基部数）×100%。

生根培养。继代丛生芽苗高4～6cm时，切下接种到生根培养基中，每种生根培养基接种9采用7种生根培养基C1～C7，基本成分为MS、白沙糖30g/L和卡拉胶粉9.5g/L，pH5.8～6.0，其它成分见表1。分别在20d后统计生根率、单苗平均根数、根长和污染率。生根率/%=（生根的芽苗数胺种芽苗总数）×100%;单苗平均根数=总根数性根苗数;根长=总根长性根苗数;污染率/%=（污染芽数/接种总芽数）×100%。

1.2.3 培养条件

培养室各阶段温度为25～30℃，光照强度为2000～2300lx，光照时间控制为14h/d。

1.2.4 组培苗的移栽

取出组培苗，洗净根部培养基，0.1%的百菌清溶液浸泡30min，移栽到进口泥炭：红壤：腐叶土（V/V/V=1：1：1）的基質中。统计成活率和观察长势。成活率/%=（成活的苗数/种的苗数）×100%。

1.2.5 数据分析

采用excel 2016整理数据，应用SPSS16.0软件的One-Way ANOVA模块进行方差分析和LSD法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 小花山奈芽基部的有效增殖

由表2和图2可知，经20d培养后，不同的6-BA和NAA浓度对小花山奈芽基部增殖有明显的影响。启动率低于80%的为A6;启动率在80%～90%的为A2和A4;启动率在90%～100%的为A5、Al和A3，其中A6的启动率显著低于其它5种培养基。芽基部增大倍数依次为A3>A1>A5>A2>A4>A6，其中A1和A3显著大于A5、A2和A4，A1和A3之间差异不显著;A6显著低于A5、A2和A4，后三者之间差异不显著（表2）。由于A3的污染率高（13.33%），A6的启动率低于80%。因此，培养基A1为小花山奈的最佳芽基部增殖培养基;小花山奈的有效芽基部继代增殖，6-BA的浓度为8.0～10.0mg/L，NAA为0～0.10mg/L。

2.2 小花山奈丛生芽诱导

不同激素浓度对小花山奈芽基部的丛生芽诱导的影响见表3和图3。由表3可看出，6种丛生芽诱导培养基的启动率均在90%以上;出芽数依次为B1>B5>B6>B4>B2>B3，其中B1的出芽数显著高于B5，B6、B4、B2和B3之间差异不显著。由图3可看出，B1培养基可分化出4～5个丛生芽，叶绿且丛生芽长势好;B4、B5和B6培养基可分化出2～4个丛生芽;B2和B3培养基可分化出2～3个丛生芽。因此，小花山奈芽基部的丛生芽的诱导，6-BA的适合浓度为3.0～5.0mg/L，NAA的适合浓度为0.050.10mg/L，其中以6-BA3.0mg/L和NAA0.05mg/L为最佳，有长势好、数量多的丛生芽

2.3 小花山奈的生根培养

由表4可看出，除C7外，C1～C6培养基的生根率在80%以上，其中平均每株生根数最多和根长最长的为C4培养基，即NAA0.10 mg几、15%香蕉泥以及1g几活性炭的培养基。由图4可看出，C4培养基上苗的根数最多和根长最长。

2.4 小花山奈组培苗移栽

将小花山奈的组培苗洗净根部培养基，0.1%的百菌清溶液浸泡30min，移栽到进口泥炭：红壤：腐叶土（V/V/V=1：1：1）的基质中，湿度控制70%～90%，温度控制25～32℃，自然光照覆盖两层遮阴网，成活率达85%以上，长势良好，见图5。

3 讨论与结论

由于姜科植物的多样性，不同姜科植物的组织培养步骤和培养基也不同。目前，红姜花、白姜花、海南三七、山奈、土田七、姜黄和芒果姜等姜科植物采用不同的外植体，如未成熟花丝、花药、茎尖、叶、叶鞘、块茎芽、幼嫩根茎和根茎芽基部，进行了外植体灭菌技术、离体培养条件和培养基配方筛选方面的研究，建立了较好的组织培养快繁体系[5-15]。小花山奈的研究集中在药理成分和光合特性方面[16-17]，其组织培养方面的报道鲜见。

笔者前期研究发现，取小花山奈块茎上萌发的芽基部为外植体时，接种至诱导培养基MS+6-BA3.05.0mg/L+NAA0.10mg/L+椰汁10%+蔗糖20g/L+卡拉胶粉9.5g/L，芽的诱导率为0;但取海南三七根茎芽基部为外植体时，其丛生芽的最佳诱导培养基为MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.10mg/L+3%蔗糖+卡拉胶粉10g/L+10%。椰汁[6]。因此，不同的山奈属植物其组织培养的步骤和培养基也不同。本研究取小花山奈无菌苗的芽基部为外植体时，调整培养基中6-BA和NAA的浓度，采取先增殖芽基部，然后切割增殖的芽基部后，再转移至丛生芽诱导培养基，这一过程可有效诱导丛生芽，可在短期内获得大量性状稳定的小花山奈种苗。

本试验结果表明，小花山奈芽基部继代增殖比较合适的培养基为MS+6-BA8.0～10.0mg/L+NAA0～0.10mg/L+椰汁10%+白砂糖30g/L+卡拉胶粉10g/L，最佳的继代增殖培养基为MS+6-BA8.0mg/L+椰汁10%+白砂糖30g/L+卡拉胶粉10g/L;丛生芽诱导比较合适的培养基为MS+6-BA3.05.0mg/L+NAA0.05～0.10mg/L+椰汁10%+白砂糖30g/L+卡拉胶粉10g/L，最佳的丛生芽诱导培养基为MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.05mg/L+椰汁10%+白砂糖30g/L+卡拉胶粉10g/L;生根最佳的培养基为MS+NAA0.10mg/L+香蕉泥15%十活性炭1g/L+白沙糖30g/L+卡拉胶粉9.5g/L。本研究成功建立了小花山奈无菌苗芽基部的组培快繁体系。

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