陆地棉微管蛋白基因Ghtub12转棉花研究

沈浙南　沈秋平　彭求

摘要：棉花（Gossypium spp.）是重要的纤维作物，棉花微管蛋白基因在棉纤维发育过程中特异优势表达，影响棉纤维品质。微管蛋白基因Ghtub12为Tubulin基因家族中的一员，在棉纤维发育中机理尚不明确。以陆地棉（Gossypium hirsutum Linn.）R15下胚轴为受体，以0.5 mg/L Basta为筛选标记，用农杆菌介导法将Ghtub12遗传转化棉花。100个胚轴段经过抗性愈伤组织诱导，得到143块愈伤组织，出愈率为71.50%；再经过3次抗性筛选获得126块愈伤组织，对愈伤组织进行PCR检测，102块检测出bar基因，即抗性愈伤组织转化率为81.00%；其中有45块愈伤组织诱导产生胚性愈伤组织，分化率为44.12%。胚性愈伤组织进行成苗培养得60株苗，对其进行PCR检测，56株扩增出条带，阳性率为93.3%。获得了转微管蛋白基因Ghtub12棉花，为进一步研究Ghtub12基因在棉花中的可能机理和作用提供了试验材料。

关键词：陆地棉（Gossypium hirsutum Linn.）R15；陆地棉微管蛋白基因Ghtub12；农杆菌介导法；下胚轴

中图分类号：S562 文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2018）18-0106-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.18.027 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study on Micro-tubulin Gene Ghtub12 to Cotton in Gossypium hirsutum

SHEN Zhe-nan，SHEN Qiu-ping，PENG Qiu，LYU Zun-fu，LI Fei-fei

（College of Agriculture，Zhejiang A&F; University，Hangzhou 311300，Zhejiang，China）

Abstract： Cotton is the world's important fiber crop， cotton tubulin gene in cotton fiber development process specific advantages of expression， affecting cotton fiber quality. Tubulin gene Ghtub12 as a member of the tubulin gene family， the mechanism of cotton fiber development is not clear. In this experiment， R15 hypocotyls were used as acceptor， and 0.5 mg/L Basta was used as a screening marker. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation method was used to study the genetic transformation. 100 calli were induced by resistance callus， and 143 callus were obtained after 1 month. The recovery rate was 71.50%. After 3 times， the callus was obtained and the callus was obtained. The transformation rate was 81.00%. Among them， 45 callus induced embryogenic callus， the differentiation rate was 44.12%. Embryogenic calli were divided into 60 seedlings. The positive rate was 93.3%. The transgenic tubulin gene Ghtub12 was obtained， which provided experimental material for further study on the possible mechanism and effect of Ghtub12 gene in cotton.

Key words： Gossypium hirsutum Linn. R15； Gossypium tubulin gene Ghtub12； agrobacterium-mediated method； hypocotyls

棉花（Gossypium spp.）是重要经济作物，常以杂交育种来提高棉花产量和增进棉花品质[1]。但研究发现棉花产量和品质在遗传上存在一定负相关，通过常规育种很难短期内实现棉花产量和纤维品质同步提升[2]。隨着植物生物技术的发展，人们通过外源基因导入棉花基因组，能有效提高棉花产量和品质[3]。棉花转基因技术打破物种间生殖隔离，有目的地将优良基因导入棉花[4]。现常将转基因育种和常规育种结合，在短期内可有效提高棉花产量[5]。目前，国内外已培育出抗除草剂（转bar基因等）[5]、抗虫（转bt基因等）[6，7]、抗病（转ptsI基因、hpaXm基因等）[8-10]、抗逆境（转GhGR基因等）[8]和优良品质改良（转14-3-3L基因等）[11，12]等转基因棉花。抗虫棉已在国内多个地区广泛推广并种植[13]。

目前，棉花转基因常用方法是以棉花体细胞胚胎发生为再生方式的农杆菌介导法。农杆菌介导法受棉花基因型限制，仅在部分陆地棉上成功，如珂210、珂312、中棉所系列[14，15]。2007年吴慎杰等[16]将基因Gus导入泗棉3号下胚轴，愈伤组织诱导率73.7%，分化率3.6%。2013年欧婷[17]用农杆菌将基因EPSPs-G6导入中棉所49茎段，转化率4.6%；2014年肖向文等[18]利用农杆菌介导法将Agip1基因导入新陆早33号棉花下胚轴，在Basta浓度为2.5 mg/L的条件下出愈率21.9%，抗性愈伤率19.1%。2016年蔡云巧[19]用农杆菌LBA4404将基因ATSUS3导入CRR14棉花下胚轴，出愈率92.5%，分化率21%。2016年肖松华等[20]利用农杆菌介导法将Gafp基因导入陆地棉苏研060下胚轴，出愈率71.4%，分化率4.1%。

棉花是重要纤维作物，纤维品质对棉花经济价值具有重大影响。棉纤维发育过程可划分为4个阶段，即纤维起始、初生壁形成、次生壁形成、纤维脱水成熟[21]。在棉纤维初生壁和次生壁形成期，主要进行细胞伸长与生长，该过程对棉花纤维品质产生重要影响，初生壁阶段直接影响棉花纤维长度，次生壁阶段直接影响纤维强度[22]。Tubulin基因家族与纤维伸长具有相关性，即在棉纤维伸长期与微管蛋白有着密切的关系。Chandler等[23]于1978年前提出“multi-tubulin”假说，认为不同微管蛋白异型体组成了细胞内不同微管结构。由α微管蛋白和β微管蛋白二聚体组成微管蛋白的基本单位。2002年李园莉等[24]用EST方法得到一个微管蛋白基因Ghtub1，并用Noether杂交技术，对Ghtub1基因在不同器官和发育时期进行跟踪观察。研究发现Ghtub1基因仅在纤维形成过程中进行表达，即Ghtub1基因对纤维发育特异性发挥作用。2016年曾志峰[25]利用农杆菌转化法将Ghtub7基因转入翼棉14中，发现Ghtub7在纤维次生壁形成过程中高效表达，对棉纤维强度与长度有重要影响。当Ghtub7在这一过程中过度表达时纤维长度减少8.73%～12.20%，当人为去抑制Ghtub7表达时纤维长度会增加13.2%～15.2%。目前为止，已知的Tubulin基因家族在主要种植陆地棉中有38个成员，但在棉纤维发育过程中的调控机理还未明确报道过。

Ghtub12基因在棉纤维初生壁形成期进行优势表达，对棉花纤维品质具有重要影响。本研究选取陆地棉R15为材料，用农杆菌介导法，将微管相关基因Ghtub12转化棉花R15下胚轴，经抗性愈伤组织诱导和增殖、胚性愈伤组织诱导、胚状体分化、成苗及PCR检测等过程，获得转基因植株，为进一步研究Ghtub12基因在纤维形成阶段的作用机理和提高纤维品质。

1 材料与方法

1.1 材料

陆地棉R15种子，含Ghtub12基因农杆菌LBA4404菌液。

1.2 方法

1.2.1 无菌苗培养及受体制备 取陆地棉R15种子用75%乙醇消毒30 s，30%H2O2浸泡3～4 h，在超净台上用无菌水洗涤3～5次，用无菌水浸泡过夜至种子露白。用无菌水洗涤露白种子2～3次，将处理好的种子按每瓶6颗接种C1培养基（1/2MS+8.5 g/L琼脂）上，在28 ℃下暗培养使其萌发，待茎有明显伸长时，进行光照处理。7～9 d后，取无菌苗下胚轴在超净台上切取剪0.5～1.0 cm作受体备用。

1.2.2 棉花遗传转化过程 含Ghtub12基因的农杆菌菌液培养至OD600 nm为1.0左右，用液体培养基C2（MS+0.1 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L KT）将菌液稀释至OD600 nm为0.6～0.8。侵染R15的胚轴段8～10 min，用无菌滤纸吸干表面菌液，转接至铺滤纸的共培养C3培养基（MS+0.1 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L KT+8.5 g/L琼脂+30 g/L葡萄糖+50 mg/L AS）中，25 ℃，暗培养48 h。培养后的下胚轴用含500 mg/L头孢霉素无菌水洗涤1次，用无菌滤纸吸去水，然后按每瓶5段将其转移到选择C4培养基（MS+0.1 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L KT+2.5 g/L Gelrite+30 g/L葡萄糖+0.75 g/L MgCl2+300 mg/L特美汀+0.5 mg/L Basta）上，25～30 d继代一次，待抗性愈伤组织长到直径为3～5 mm时，将其从胚轴段切下来，按照每瓶5～6个愈伤组织来接种C4培养基，进行继代培养。待愈伤组织增殖至直径为7～8 mm时，转接在胚性愈伤组织诱导C5培养基（MS+2.5 g/L Gelrite+30 g/L葡萄糖+0.75 g/L MgCl2+1.9 g/L KNO3）上，每25 d继代一次。直至出现黄绿色或乳白色呈球形颗粒的胚性愈伤组织，及时将胚性愈伤组织单独挑取继代在C5培养基上进行增殖。将胚性愈伤组织散铺在铺滤纸的分化C6培养基（MS-NH4NO3+3.0 g/L Gelrite+30 g/L葡萄糖+0.75 g/L MgCl2+0.5 g/L天冬酰胺+1.0 g/L谷氨酰胺）上，每15 d继代1次，约1～2个月可诱导胚状体形成。胚状体进一步萌发成苗，将小苗单独挑取出来继代在C5培养基上，待长出3～5片真叶时，温室嫁接成活。

1.2.3 愈伤组织以及转基因小苗的PCR检测 用CTAB法提取愈伤组织和转基因小苗叶片的DNA，用bar基因的引物（F：ACCATCGTCAACCACTACA TCG；R：GCTGCCAGAAACCCACGTCAT）进行PCR扩增，扩增片段大小为420 bp。

2 结果与分析

2.1 愈伤组织诱导、转化及分化

选取100个胚轴段作为转化受体，60 d后，出现143块愈伤组织，愈伤组织诱导率为71.5%。用Basta作为筛选标记，经3次筛选，获得了126块愈伤组织。每块取部分愈伤组织进行DNA提取，其余继续增殖培养。用bar基因引物进行PCR扩增，共有102块愈伤组织扩增出目的条带，检测转化率为81.0%（图1）。图1是部分愈伤组织PCR检测结果，除了泳道6和8外，均扩增出目的条带。

将102块抗性愈伤组织进行胚性愈伤组织诱导和分化培养，经过3～5次继代，有45块愈伤组织在培养基的接触面出现胚性愈伤组织，分化率为44.12%（图2）。

2.2 抗Basta转化棉花和植株再生过程

R15种子经过5～7 d培养获得无菌苗（图3A）；5～7 cm的胚轴段和农杆菌菌液侵染后，进行共培养，将培养2 d后表现绿色，无褐化下胚轴（图3B）转入C4抗性愈伤组织诱导培养基中，经过2～3月培养，胚轴段颜色变深，两端长出抗性愈伤组织（图3C）；出愈率为71.50%。待愈伤组织长大直径为3～5 cm，切下来单独继代在C4培养基上进行增殖培养，待长大7～8 cm（图3D）时，转入C5胚性愈伤组织诱导培养基中，在愈伤组织和培养基接触面出现淡黄色，小颗粒状胚性愈伤组织（图3E）；及时挑取，进行增殖培養得到大量黄色胚性愈伤组织（图3F）；转入铺有一层滤纸的C6培养基，部分胚性愈伤组织形成胚状体（图3G）。胚状体单独挑取进一步发育成小苗（图3H），共获得了60颗转基因棉花小苗。

2.3 转基因小苗的PCR检测

将获得的60株小苗进行bar基因PCR检测。其中56株扩增出目的条带，阳性率高达93.3%。说明经本试验选取0.5 mg/L Basta浓度是可行的。

3 小结与讨论

本试验以农杆菌介导法将Ghtub12基因导入陆地棉R15下胚轴，转化后在抗性筛选培养基中培养2个月，从100段下胚轴中诱导出愈伤组织143块，出愈率71.50%。用抗除草剂基因bar为标记基因，0.5 mg/L Basta除草剂为筛选剂，经过3个月筛选后，得126块愈伤组织，对其进行PCR检测，102块呈现目的条带，转化率81.00%。将102块获得的抗性愈伤组织进行胚性愈伤组织诱导及分化培养3～5个月后，得到胚性愈伤组织45块，分化率44.12%。将胚性愈伤组织进行分化成苗培养，得成活苗60株，有56株呈现阳性，阳性率93.3%。

目前，越来越多转化方法被应用于棉花转基因过程中，如利用高速粒子冲击的基因枪转化法[26]，利用棉花自身生殖细胞分裂分化的花粉管通道法[27]等。本试验利用的农杆菌介导法具有转化效率高、转化后代遗传稳定性好、试验技术成熟等优点被广泛应用于棉花转基因[28]。但农杆菌转化法也存在几个缺点，不仅对棉花受体自身基因型要求高（该方法普遍应用于再生能力强的基因型），通过体细胞胚胎发生建立组织培养转化体系相比其他方法更耗时耗力[29]。特别在组织培养体系中出愈率、转化率、分化率、转基因小苗阳性率将直接影响这一转化体系是否成功[29]。自棉花转基因技术形成以来，研究发现在农杆菌转化体系中影响棉花转化效率因素有很多[30]。其中农杆菌侵染液浓度、选用植物生长调节剂种类、植物生长调节剂浓度配比[31]、褐化程度对出愈率影响较大。选用的筛选剂及筛选剂浓度、筛选次数对转化率有较大影响[32]。棉花品种[33]及受体选用部位[34]是影响棉花分化率主要因素[35]。本试验中用OD600 nm为0.8的农杆菌菌液去侵染陆地棉R15下胚轴， KT：2，4-D配比为1，浓度为0.1 mg/L，在28 ℃下共培养，用0.5 mg/L Basta筛选3次后，出愈率达71.50%，转化率达81.10%，分化率达44.12%。在筛选剂选择方面，尝试用在棉花下胚轴转化体系中使用并非很广泛的除草剂Basta，在经过0.5 mg/L Basta筛选3次后，转基因小苗阳性率达93.3%。本试验中至少获得了56株阳性植株，说明Basta筛选成功率较高，能有效地将转化成功的愈伤组织筛选出来。从转化效率看，本转化体系基本达到预期效果，为进一步研究Ghtub12基因作用打下基础。

Ghtub12基因作为一个微管蛋白基因，可能参与棉花纤维发育形成过程。结构蛋白是棉纤维形成过程中的重要蛋白，在纤维细胞形成期对纤维细胞横向与纵向排列有决定作用，进而影响棉纤维长度与厚度[36]。Ghtub12基因可能直接编码成纤维形成过程中的结构蛋白，通过结构蛋白影响纤维排列方向，从而影响纤维结构组成，进一步影响纤维长度与强度。棉纤维形成过程中受到各种植物生长调节剂的调节，生长调节剂在棉纤维成型过程表达时间与表达量，会直接影响纤维形成4个阶段时间长短，从而影响棉花品质[37]。Ghtub12基因編码成影响纤维形成相关激素蛋白，通过生长调节剂的调节，影响纤维形成不同阶段时间长短，进而影响纤维品质。

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