黑色素与生物农药配伍优化及其对棉田产量的影响

朱静，张志东，刘晓静，唐琦勇，王博，顾美英，宋素琴，王玮，张丽娟

(1.新疆农业科学院微生物应用研究所，乌鲁木齐 830091；2.新疆农业大学食品科学与药学学院，乌鲁木齐 830052)

0 引 言

【研究意义】在生物农药推广应用中，光线特别是紫外光对农药的影响最为突出。光线易促使农药加速降解，减慢药效发挥，降低药效或造成防治效果不稳定。新疆作为强太阳光辐射地区，生物农药失效速度更快，往往需夜间施药，或需多次施药，增加了使用成本[1]。自20世纪80年代以来，越来越多来源于植物和微生物的农药光保护剂被研究发现[2,3]，这些光保护剂能有效的保护生物农药的光破坏特别是紫外光的破坏，且多数为生物安全和环境友好性助剂，但其高昂的提取和合成成本，往往优先用于化妆品中[4]，且在使用农药时，一般需添加农药的1%以上才会起到较好的效果[5]，提高生物农药的销售价格及防治成本，还需要探索更适于生产和推广的光保护剂。【前人研究进展】天然黑色素(melanin)是一种广泛存在于动植物和微生物中的非均质类多酚聚合体，是一类高分子量褐色-黑色素的总称[6]。黑色素在紫外线和可见光波长(150～800 nm)均具有良好的光吸收作用，其清除自由基、抗氧化功能均优于SOD、VE等常规抗氧化产品，是理想的生物农药光保护剂[7,8]。出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)是工业生产重要生物材料短梗霉多糖(英文名Pullulan)的生产菌株，此前的研究和生产中，发现该菌在发酵后期易代谢出黑色素，其与多糖牢固结合，具有良好的水溶性。【本研究切入点】前期从新疆辐射污染土样中分离筛选出一株出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)菌株MF1[9]，可产生水溶性黑色素，具有较好的热、酸碱稳定性，并且对H2O2、NaClO和金属离子有较好的耐受性。其发酵条件简单，成本低，易于工业化生产，极具开发应用价值。研究天然黑色素对生物农药的光保护作用。【拟解决的关键问题】将短梗霉发酵的黑色素溶液与生物农药配伍，用于棉田喷洒。通过裂区试验研究生物农药与黑色素对蚜虫杀虫率及棉田产量的影响，分析生物农药与黑色素的最佳浓度配比，为天然黑色素在生物农药中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试验地点

试验地点为新疆石河子市148团(E 86°16' 24.870"，N 44°46' 05.882")，该区域地处古尔班通古特大沙漠南缘，平均海拔高度450.8 m，属典型的温带大陆性气候，冬季长而严寒，夏季短而炎热，平均气温25.1～26.1℃，无霜期为168～171 d，年降水量为125.0～207.7 mm。试验小区所在棉田常年种植棉花，连作年限10 a以上。棉田种植采用膜下滴灌，机械化耕作。

1.1.2 菌种及试剂

试验菌株出芽短梗霉(Aureobasidiummelanogenum)MF1分离自新疆辐射污染环境土壤，由新疆农业科学院微生物应用研究所提供。

棉花品种为新陆早30号(新疆石河子下野地试验站繁育)；苏云金杆菌Bt(广州多宇多生物科技有限公司)、阿维菌素(河北省农药化工有限公司)和甲维丙溴磷(山东新势立生物科技有限公司)。

1.1.3 培养基

种子培养基(MEA 培养基)：麦芽浸粉30 g，大豆蛋白胨3 g，纯净水1 000 mL，pH 自然。

发酵培养基：葡萄糖30 g，酵母浸膏2.02 g，磷酸氢二钾3.0 g，硫酸铵2.0 g，NaCl 0.5 g，CuSO40.16 mg，纯净水1 000 mL，pH自然。

1.1.4 仪器与设备

PL203 电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；SPX-150B 生化培养箱，宁波东南仪器有限公司；HZQ-F160 全温振荡培养箱，哈尔滨东联电子技术开发有限公司；Eppendorf 5424 离心机，德国 Eppendorf 股份公司；UV-2550 紫外分光光度计，日本岛津仪器(上海)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

黑色素对生物农药的保护作用及对棉花产量的影响试验采用裂区试验设计[11]，农药使用与农田生产所用一致，即每667 m2Bt 50 g、阿维菌素10 mL、甲维丙溴磷 25 g，溶于50 kg水中，喷洒。裂区试验设计以农药用量为主处理，黑色素使用量为副处理。农药用量以农田使用量为100%，设A1～A3分别为100%、75%、50%三个梯度；黑色素使用量以每667 m2使用黑色素2.5 g为100%，设B1～B7的0、10%、20%、40%、60%、80%、100%七个浓度梯度。试验共有21个处理，3个重复，共设63个小区。小区面积5 m×4.6 m，采用随机设计分布，试验过程采用人工背负式喷雾器打药，喷水量为50 kg/667 m2，均匀喷雾，其他管理措施与非试验棉田基本相同。

1.2.2 黑色素发酵

从新鲜斜面挑取一环菌苔，接种于液体种子培养基试管中，30℃，180 r/min 摇床培养36 h，取2 mL 接种于摇瓶中(500 mL三角瓶装200 mL种子培养基)，30℃，180 r/min 摇床培养2 d，按5%接种量接种于10 L全自动发酵罐，进行发酵生产。10 L全自动发酵罐发酵条件：发酵培养基装填量7 L，起始pH 6.2，消泡剂10 mL，通气量3.5 L/min，30℃，100 r/min，发酵5～7 d。发酵结束后，将发酵液高温灭菌，离心去除发酵杂质及菌体，上清液放置在4℃冰箱备用[10]。

1.3 数据处理

蚜虫数量测定：于施药前1 d和施药后1、3、5 d，采用对角线5点取样，每点随机调查10株棉花，每株调查5片叶的蚜虫数[12]，分别统计蚜虫数量。试验数据用SPSS 18.0统计分析软件进行Duncan’s分析[13]。

棉花产量测定：待棉花收获时，每个处理小区采用人工采摘，并进行单收单晒以计算籽棉产量。试验数据用SPSS 18.0统计分析软件进行Duncan’s分析。

2 结果与分析

2.1 裂区试验对蚜虫数量的影响

将试验原始数据整理成主区A因素(生物农药浓度)与裂区B因素(黑色素浓度)施药前蚜虫基数和施药1、3和5 d后蚜虫数量两向表，计算生物农药与黑色素配伍施用后杀虫百分率。对杀虫率两因素裂区试验进行方差分析。F测验结果表明：施药天数间，天数×A的P值都大于0.05，说明三次重复之间以及因素A与三次重复之间的交互作用差异不显著。A因素、B因素、A×B互作均达到极显著差异，不同的农药浓度、黑色素浓度杀虫效率不同，两个因素需要合理组合才能获得最好的杀虫效果。分别对因素A、因素B进行多重比较并对A×B交互作用进行分析。表1～4，图1

表1 各小区蚜虫防治效果
Table 1 Control effect of aphid in each plot

注：表中活虫头数为3次重复的平均值，下同

Note： The number of live insects in the table is the average of 3 replicates, the same as the table below.

表2 裂区试验对蚜虫数量影响方差
Table 2 Variance analysis of split-plot tests on aphid populations

变异来源Sources of variation自由度dfDegree of freedom平方和SSSquare sum均方S2Mean SquareF值F valuePP value施药天数 Application days22.7331.3661.5460.260因素A Factor A218.5919.29539.7580.002误差 Error40.9350.234因素B Factor A6177.62629.60434.3800.000误差 Error1210.3330.861A×B1240.1033.34215.8300.000误差 Error245.0670.211

图1 因素A与因素B对杀虫率交互作用
Fig.1 The interaction of factor A and factor B on pesticidal rate

研究表明，因素A的三个水平分属不同子集，其中A2的杀虫效率最高，均值为95.47%。七个水平分属5个不同的子集，其中B7的杀虫率最高，均值97.42%。A3B7组合时达到最高值，即农药浓度选择原液浓度的50%，黑色素使用量为100%时，即每667 m2使用Bt 25 g、阿维菌素5 mL、甲维丙溴磷12.5 g，黑色素2.5 g，可实现最大的杀虫率，均值是97.7%。表3，表4，图1

表3 主区因素A主效应多重比较
Table 3 Multiple comparison analysis table

of main factor A main effect Duncana,b

注：误差项为均值方(错误)=0.38；a.使用调和均值样本大小=3.000；b.Alpha=0.05

Note： The error term is the mean square (error) = 0.38； a.Use the harmonic mean sample size = 3.000

表4 裂区因素B主效应多重比较

Table 4 Multiple comparison analysis table of secondary factor B main effect Duncana,b

注：误差项为均值方(错误)=0.428；a.使用调和均值样本大小=9.000；b.Alpha=0.05

Note： The error term is the mean square (error) = 0.428； a.Use the harmonic mean sample size = 9.000

2.2 裂区试验对棉花产量的影响

从方差分析中看出主区因素A、A×B的交互作用引起的产量没有差异性，但裂区因素B之间存在一定的差异性。主区三个处理之间没有显著性差异，三个处理下棉花产量由大到小的顺序是A3>A2>A1。裂区7个处理之间存在一定的差异性，产量随着黑色素的使用量增加而提高。A3B7处理的产量最高，即生物农药浓度选择原液浓度的50%，黑色素使用量为100%时，即每667 m2使用Bt 25 g、阿维菌素5 mL、甲维丙溴磷12.5 g，黑色素2.5 g棉花产量最高，其结果与蚜虫最佳防治组合一致，小区平均单产可以达到14.3 kg。表5～8，图2

表5 各小区棉花产量
Table 5 Cotton production in each plot(kg)

主区Main treatment裂区Secondary treatment重复ⅠRepeatⅠ重复ⅡRepeatⅡ重复ⅢRepeatⅢ平均值MeanA1B18.251111.510.3B210111110.7B310.59.513.511.2B412.21112.511.9B510.5131211.8B613.51412.513.3B7141513.514.2A2B1910.59.79.7B210.511.512.511.5B31012.51311.8B411.512.513.512.5B5151311.2513.1B613.513.51514B715.25141314.1A3B198.759.259B210.5149.511.3B3141210.512.2B412.2513.513.513.1B51412.51413.5B6141412.513.5B715131514.3

表6 裂区试验对棉花产量影响方差
Table 6 Variance analysis of split-plot tests on cotton production

变异来源Sources of variation自由度dfDegree of freedom平方和SSSquare sum均方S2Mean SquareF值F valueP值P value区组 Plot21.4830.7421.3480.656误差 Error0.4210.2320.550因素A Factor A23.5241.7621.3200.363误差 Error45.3411.335因素B Factor B6127.39621.23318.1580.000误差 Error1214.0321.169A×B128.9990.7500.3840.957误差 Error2446.9061.954

表7 主区因素A主效应多重比较

Table 7 Multiple comparison analysis table of

注：误差项为均值方(错误)=0.19；a.使用调和均值样本大小=3.000；b.Alpha=0.05

Note： The error term is the mean square (error) = 0.19； a.Use the harmonic mean sample size = 3.000

表8 裂区因素B主效应多重比较
Table 8 Multiple comparison analysis table of

secondary factor B main effect Duncana,b

注：误差项为均值方(错误)=1.693；a.使用调和均值样本大小=9.000；b.Alpha=0.05

Note： The error term is the mean square (error) = 1.693； a.Use the harmonic mean sample size = 9.000

图2 因素A与因素B对产量交互作用
Fig.2 The interaction of factor A and factor B on production

3 讨 论

新疆作为我国棉花集中生产区，2016年棉花产量占到全国棉花产量的80%。新疆棉区气候干燥，降水稀少，日照时间长且强度大，全年日照时数为2 550～3 500 h，日照百分率60%～80%[14]，为新疆棉花优质高产创造了优良的自然条件。但在虫害发生时，长时间高强度的日照也严重破坏了生物农药的作用。相关研究表明，我区生物农药苏云金芽孢杆菌(Bt) 在使用过程中，阳光直射30 min，芽孢死亡率即达50%左右，照射1 h死亡率达80%，其伴胞晶体也随之变形降效，甚至无效；阿维菌素及棉铃虫多角体病毒在阳光照射下也会迅速失效[15,16]。因此，自20世纪80年代以来，光保护剂作为生物农药的重要助剂之一，寻找高效、安全、经济的农药光保护剂一直是生物农药研究的主要领域之一。

研究中采用的天然黑色素具有极强的抗日光及紫外线照射作用，且具有较强的酸碱、热稳定性，同时对氧化还原反应不敏感，具有螯合部分重金属的作用[17]。使用之前只需将发酵液高压灭菌后，简单过滤即可与生物农药直接混合喷洒。与其他光保护剂或黑色素制品相比，价格低廉，操作简易，环保安全。在大田条件下，研究以生物农药用量为主处理，黑色素用量为副处理进行裂区试验。通过试验优化，当农药浓度为原液浓度的50%，黑色素浓度为100%时，即每667 m2使用Bt 25 g、阿维菌素5 mL、甲维丙溴磷12.5 g，黑色素2.5 g时，试验小区平均蚜虫杀虫率最佳，可达到97.7%，平均棉花产量达14.3 kg。而相同条件下未使用黑色素的对照试验小区中，蚜虫平均杀虫率仅为92.3%，棉花平均产量10.3 kg。试验发现，部分小区的杀虫效率和棉花产量随着黑色素使用的浓度升高而提高。在研究中生物农药的使用量却并非越高越好。无论杀虫率或棉花产量，均在农药使用量为常规用量浓度的一半时(50%)效果最佳，这一结果可能是由于单位黑色素对生物农药的保护作用有限，当农药浓度过大时，现有浓度的黑色素难以进行保护从而导致农药效果下降。因此，75%和100%浓度的农药使用效果反而不佳。

通过对未加黑色素的生物农药防效的分析发现，在试验中生物农药的推荐使用量与使用其一半时的防效几乎无差别。过量施用、盲目施用农药和化学肥料，会导致农田土壤健康情况下降，导致植物生长情况变差和病虫害的多发。研究利用天然黑色素与生物农药的配伍，不仅可以提高生物农药的使用效率，减少农药的施用量，降低生物农药的使用成本，对维护良好的农业生态环境具有积极的作用。

4 结 论

通过农药浓度与黑色素浓度裂区试验对蚜虫杀虫率及棉田产量进行研究，当农药浓度为原液浓度的50%，黑色素浓度为100%时，即每667 m2使用Bt 25 g、阿维菌素5 mL、甲维丙溴磷12.5 g，黑色素2.5 g时，可达到97.7%的最大蚜虫杀死率，以及均值14.3 kg/小区的最大棉花产量，显著高于对照小区的试验结果。研究生物农药与黑色素的最佳浓度配比，为天然黑色素在生物农药中的应用提供一定的理论依据。