脊髓损伤急性期内源性酮体增加对脊髓损伤大鼠的保护作用研究*

张丽河 洪毅,2** 王方永,2 姜树东,2 李想,2 刘介生,2

（1.首都医科大学康复医学院，北京 100068；2.中国康复研究中心北京博爱医院脊柱外科，北京 100068）

脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）可造成不可逆性的神经损伤，导致损伤水平以下的运动、感觉、自主神经功能障碍，并伴随继发各种并发症。当前SCI尚无治愈方法，为了改善急性SCI的神经功能，研究者们致力于多个领域探索[1]，包括手术减压、药物治疗、低温处理、促神经再生等治疗手段，但效果均欠理想。因而，探索治疗SCI治疗新策略有着愈发重要的意义。

1920年引入了高脂肪、低碳水化合物和适当蛋白质的生酮饮食（ketogenic diet,KD），模拟人体在饥饿状态时，由脂肪代谢产生的酮体作为能源物质为重要器官供能的过程，最初用于儿童癫痫的预防性治疗，其安全性和有效性已得到肯定[2,3]。KD在神经系统疾病中的应用越来越多，在阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化和SCI的啮齿动物模型中[4-6]，KD能有效改善运动功能，促进神经功能恢复。近年来，Streijger等[4]进行了KD对急性SCI运动功能恢复的研究发现，KD喂养后大鼠的前肢功能可获得更好的恢复。郭超凡等[7]进行临床研究，初步证明对急性SCI患者进行KD治疗具有安全性和可行性。

生酮比率（ketone ratio,KR）系饮食中脂肪质量与碳水化合物加蛋白质质量的比值[8,9]，比率越高生酮强度越强。据报道[10]，KD治疗不仅表现为KR越高，酮体水平越高，更重要的是其控制癫痫发作更有效。迄今为止，尚无有关KD对胸脊髓损伤神经的保护作用及与KR的相关性文献报道。本研究主要致力于探索不同水平急性内源性酮体增加对脊髓损伤组织的保护作用及与运动恢复之间的关系，为进一步实验研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

36只成年雌性SPF级Sprague-Dawley大鼠，体质量(250±20)g，由中国军事医学科学院实验动物中心提供。买入后适应实验室环境4 d，随机分为3组，每组12只。A组大鼠摄入标准饲料，B组和C组大鼠分别摄入KR为3.1∶1和6.1∶1的生酮饲料，3组大鼠进食热量一致。本研究饲料均由南通特洛菲有限公司配制，对照组和实验组饲料能量分布及脂肪酸构成分别如表1和表2所示。于造模前1周给予相应的饮食预处理，每日分3次填加饲料，及时清理盘中残余饲料。

1.2 实验试剂

TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（显色法），兔抗神经丝蛋白(neurofilament,NF)-200单克隆抗体(1∶100)，抗荧光衰减封片剂，DAB浓缩型试剂盒，4%多聚甲醛，PBS缓冲液(pH 7.2～7.4)，由北京奥博特生物科技有限公司提供。大鼠酮体ELISA试剂盒（北京冬歌生物科技有限公司）。青霉素(80万U/支，江西省科达动物药业有限公司)。

1.3 模型制备

本研究操作均采用盲法。大鼠术前禁食12 h，称重，2%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔麻醉。以大鼠胸10棘突为中心，严格无菌操作下行背部皮肤纵行切口，沿棘突分离椎旁肌肉，剥离附着于棘突和椎板上的软组织，显露椎板，咬除胸10椎板，于胸10椎骨节段施行椎板切开手术，打开椎管，暴露胸10脊髓节段，为了避免血管、脊髓损伤，以上操作均在显微镜下进行（奥林巴斯-SZ61）。在显露的硬脊膜处，用小号无齿平镊完全夹持大鼠胸10脊髓节段，持续15 s制造大鼠SCI模型[11]。造模成功后以生理盐水冲洗伤口，彻底止血后逐层缝合肌肉、浅筋膜和皮肤。

表1 3组饲料能量分布

表2 3组饲料脂肪酸构成（%）

1.4 术后护理

饲养温度控制在22℃左右，定期通风：12 h光照循环；定期更换垫料，保持笼内干燥。术后每天2次行青霉素钾肌肉注射，持续5 d。每日3次挤压膀胱协助排尿，至恢复膀胱排尿反射；每日3次轻揉大鼠腹部及双后肢，预防肠梗阻和压疮发生。

1.5 检查方法

1.5.1 BBB评分：采用BBB行为评分法(Basso-Beattie-Bresnahan score,BBB)观察大鼠后肢运动功能恢复情况[12]。于术后每周对各组大鼠进行评分，评分在开放环境中进行，每次评分均在晚上进行，均保存录像资料。主要根据实验动物髋、膝、踝关节，行走、躯干运动、协调性情况进行评分[12]。本实验中采用双人独立观察记录，评分人员为熟悉评分规则的非本组实验人员，最后结果取平均分。

1.5.2 血、尿酮体：于饮食干预前、饮食干预后第1、3、5、7、9周测定血清酮体和尿酮体水平。采用眼眶静脉采血技术留取血液标本[13]，尿液通过代谢笼分离出大便进行收集。最后采用ELISA测量血清和尿液中β-羟丁酸（β-hydroxybutyrate，β-HB）的浓度。

1.5.3 运动诱发电位（motor evoked potential，MEP）检测：采用Owen等[14]研究的经椎板脊髓刺激技术。2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉下（30 mg/kg），采用神经电生理仪(MEDELEC SYNERGY，德国)进行检测。刺激电极为两对针状电极，分别放置于手术野上、下棘突间隙，即T7/8和T11/T12，阴极置于阳极尾侧，两者间距0.5～1.0 cm。记录电极也为一对针状电极，先后于双侧小腿胫前肌记录复合肌肉动作电位（compound muscle action potential，CMAP）。参考电极置于大鼠腹部。刺激方法：间隔2 s刺激1次，刺激强度9.0 mA，记录、分析MEP的振幅及潜伏期，并进行比较。

1.5.4 组织病理学检测：术后8周，将大鼠深度麻醉，经心脏灌注取出脊髓损伤节段，每个标本以损伤处为中心做连续切片，行HE染色、TUNEL凋亡检测和NF-200免疫组织化学染色，每个指标3张切片。

HE染色：常规HE染色，观察实验组和对照组损伤节段脊髓的局部大体形态变化。通过显微镜拍照，采集、分析样本损伤部位脊髓组织的形态和损伤程度。

TUNEL检测：TUNEL阳性细胞呈棕褐色。每张切片在200倍光镜下选取3个视野，计数TUNEL阳性细胞，取平均值，计算阳性细胞率。

免疫组织化学染色：NF-200阳性细胞呈褐色，采集光学显微镜200倍视野下拍照，选取3个视野，测量分析样本相关部位NF-200轴突计数，取平均值。

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。符合正态分布及方差齐性的资料以均数±标准差表示，采用单因数方差分析（One-way ANOVA）。否则，采用秩和检验(Kruskal-Wallis One-Way ANOVA)。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

大鼠SCI造模后所有受试大鼠活动量及饮食量均减少，并不同程度伴有腹部胀气、大便困难伴硬结、尿潴留、双后肢拖行等情况；少数大鼠出现血尿，规律人工挤尿后血尿好转，个别大鼠出现自噬情况。整个实验过程中2只大鼠因麻醉意外死亡，1只因误吸死亡，其余大鼠均愈合良好，无感染（表3）。

表3 各组大鼠存活率比较

2.2 B B B评分比较

所有大鼠造模前BBB评分均为21分，造模后所有大鼠BBB评分均0分。随着时间推移，运动功能缓慢恢复。3组大鼠术后1～8周BBB评分比较，差异均无统计学意义（P＞0.05，图1）。

2.3 血清酮体和尿酮体比较

饮食干预后实验组大鼠血清酮体和尿酮体水平短期内明显升高。KD干预后，各检测时间点3组大鼠血清酮体水平和尿酮水平比较，差异均有统计学意义，即C组血清酮体水平和尿酮水平显著大于B组，B组显著大于A组（图2～3）。

2.4 M E P比较

术后8周，记录3组大鼠MEP信号，分别比较3组大鼠的右侧、左侧和双侧后肢MEP的振幅和潜伏期，差异无统计学意义（表4）。

2.5 3组组织病理学比较

图1 3组大鼠术后BBB评分比较

图2 3组大鼠血清酮体水平比较

图3 3组大鼠尿酮体水平比较

2.5.1 HE染色：3组大鼠脊髓组织钳夹区域脊髓组织切片HE染色结果（图4）示，A组：白质可见大量大小不等囊泡结构，中央部分囊性扩张形成空洞，脊髓灰质区结构破坏，神经元变性，前角可见少量残存的神经元；B组：脊髓组织血管丰富，白质区疏松水肿，局部空泡变性，可见囊性扩张；C组：灰质白质区可见，白质区结构疏松水肿，局部空泡变性。由此可见，A组脊髓钳夹区域脊髓组织破坏严重，B组和C组破坏程度相对较轻。

2.5.2 TUNEL凋亡细胞标记染色：TUNEL检测阳性细胞呈棕褐色，且只有细胞核被染色，细胞核内棕褐色颗粒可在高倍镜下观察到。比较3组大鼠脊髓损伤节段神经细胞凋亡率发现，B组和C组大鼠神经细胞凋亡率均低于A组大鼠（P＜0.05，图5）。

2.5.3 NF-200免疫组织化学染色：3组均可见NF-200阳性表达细胞，神经元胞体和轴突被染成褐色，主要分布在脊髓组织白质损伤区域。比较3组间NF-200阳性细胞计数，B组和C组的NF-200阳性细胞计数显著大于A组（P＜0.05，图6）。

3 讨论

大量研究证明，KD用于神经退行性疾病、脑损伤和SCI等疾病可以达到神经功能恢复的效果。我们首次探索KD对胸SCI的保护作用强度是否与KR大小有关，通过KR为3.1∶1和比值为6.1∶1的生酮饮食配方提前作用于胸SCI大鼠，使大鼠处于预防性的生酮代谢状态，升高酮体及抑制SCI后继发性损伤导致的一系列病理变化。本研究观察到KD干预后，酮体在短时间内达到较高水平；大鼠的运动功能恢复缓慢，BBB评分未显示出明显的差异；KD干预能使大鼠脊髓变性程度减轻，增加脊髓组织保留，减少凋亡，或促进轴突再生。因此，笔者认为在一定程度上KD对SCI有神经保护作用。

既往KD被大量用于儿童癫痫的研究及应用，其控制癫痫的临床疗效毋庸置疑，目前有许多可选择的KD，如经典KD、中链甘油三酯饮食、改良阿特金斯饮食和低血糖指数治疗[15]。其中经典KD配方基于KR，临床常用KD的KR为2～4∶1[10]。KR可能在KD的功效和耐受性中起重要作用[16]。据报道，随着KR增大，KD的口感、耐受性越差，副作用越明显[10,16]。广泛使用KD可能导致早期出现胃肠道不适、酸中毒、低血糖等不良反应，以及晚期的高脂血症、肾结石等不良后果[17]。在众多的不良反应中，以胃肠道问题最为常见[18]。最新研究[19]表明，KD促进脂蛋白大小和表型发生负面变化，有发生动脉粥样硬化的风险。这些不良影响需要在其出现之前预防，如应用改良KD、减少促进副作用发生或进展的干预及定期检测[19]。但在动物实验领域，有研究对比KR从1∶1至9∶1的不同KD配方干预对大鼠的抗癫痫疗效，得出一项关于剂量反应疗效与癫痫控制关系及其神经毒性的报道[20]，KR为1∶1到9∶1的不同生酮配方，均未出现明显的神经毒性及副作用，其中6∶1KD抗癫痫效果最佳，优于4∶1或5∶1KD；饲喂1∶1KD的平均β-HB水平明显低于3∶1～8∶1组，且9∶1KD喂食动物的β-HB水平显著高于3∶1～6.3∶1组，但与8∶1KD组比较差异有统计学意义。迄今为止，尚无有关不同配方KD的剂量反应疗效与SCI后神经功能恢复的实验研究。因此，本实验选用3.1∶1和6.1∶1的KD配方，以接近临床应用，控制不良反应，并增大KR差距，更好识别不同KR饮食配方的治疗疗效。由此可见，SCI及KD喂养均可加重便秘，故本研究更加重视实验动物术后肠道护理，并不限制水的摄入。

表4 3组大鼠 M E P振幅和潜伏期的分布情况

表4 3组大鼠 M E P振幅和潜伏期的分布情况

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图4 术后8周，3组大鼠损伤节段脊髓组织大体形态（×40）

图5 3组大鼠神经细胞凋亡率比较

图6 3组大鼠轴突计数比较

大鼠SCI模型制造有多种方法，其中挫伤和压迫模型能更好地模拟人体损伤的生物力学和神经病理学变化[21]，而压迫模型具有造模一致性、操作简单、低成本、重复性好等优点，通过调整钳夹的夹力和时间的长短能复制出与临床类似的SCI[22]，适用于受损脊髓神经功能的研究和代谢改变的检测[23]。本研究采用医用无齿平镊对大鼠T10脊髓节段进行钳夹压迫模型制造[11]，将镊子头夹到底，造成严重的脊髓损伤。

运动功能是SCI后神经功能评价的一项非常重要的内容。1995年Basso、Beattie及Breshnahan研究制定了BBB行为功能评定量表[12]，该量表是目前评价截瘫大鼠后肢运动功能较为准确、可靠并且重复性高的运动行为学评定标准。据报道[24]，大鼠神经功能恢复有赖于神经组织的可塑性，若存活的神经纤维少于15%，则脊髓组织和高级中枢损伤区的可塑性便不能被证实。本研究结果显示，3组大鼠运动功能在术后恢复较差且BBB评分无显著性差异，考虑与本实验模型较重及神经可塑性差有关。

SCI后，运动传导通路受损，导致MEP潜伏期和振幅改变。MEP刺激中枢神经并在脊髓远端、周围神经或肌肉记录信号，能直接反映脊髓下行运动传导束的功能状态，对判断和评估运动功能恢复有着重要的参考意义[25]。MEP波形和幅度变化可以验证饮食干预是否促进SCI后脊髓运动传导恢复。结果显示实验组在损伤后8周的MEP振幅大于对照组，但无显著性差异，说明两组运动传导通路无显著修复，运动功能在8周时改善不显著。

急性SCI引发的继发性损伤[26]，导致病变部位从神经元细胞凋亡至完整白质束渐进性退化，初始损伤扩大，明显影响神经损伤的程度。理论上，急性SCI的治疗应该提供神经保护、增加可塑性以及轴突再生的措施。在饮食方面，KD是较为经典的饮食调节方法[2,3,5,6]，被证明可通过广泛细胞、分子机制发挥抑制活性氧产生、抗氧化、抗炎、抗凋亡及增加神经可塑性等作用，达到对神经组织的保护作用。有观点认为KD的一些功效是通过调节内生酮水平发作用[4]。

有研究[27]证实继发性SCI是神经细胞凋亡的结果。因此，有效的控制和阻断细胞凋亡，对脊髓继发性损伤的恢复起着重要作用。KD通过线粒体途径能减少创伤性脑外伤幼鼠的细胞凋亡[28]。本研究发现两实验组神经细胞凋亡少，对照组脊髓侧索部分神经细胞凋亡，证明KD抗凋亡作用，但并未证明其与KR的具体关系，考虑与神经可塑性破坏有关。

中枢神经损伤后，NF-200的表达水平可反映神经轴突损伤和修复的程度[29]。本研究选择损伤节段脊髓作为观测对象，能较好地反映神经细胞在创伤后的修复反应。通过比较NF-200阳性细胞计数，得出两实验组的NF-200阳性细胞表达数量明显多于对照组，与TUNEL检测细胞凋亡率结果相一致。说明KD疗法可能通过促进损伤部位脊髓内轴突的再生，促进神经功能的恢复。

综上所述，KR越高，酮体升高效果越好；KD能减轻脊髓组织的病理损伤程度，增加脊髓组织保留，对SCI具有一定的神经保护作用；KD疗法不能有效改善重度胸段SCI大鼠后肢运动功能，未得出运动功能恢复与KR的确切关系。这种保留脊髓损伤组织的饮食干预为SCI后促进神经保护提供了一个潜在方案，但关于其作用机制及合适的KR有待进一步研究与探讨。