不同产地青钱柳多糖的体外抗氧化及α葡萄糖苷酶抑制活性

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(贵州师范大学生命科学学院,贵州贵阳 550025)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一类以高血糖为主要特征的代谢性疾病,随着人们生活水平的提高,糖尿病的发病率逐渐增高,严重威胁人类的生命健康[1]。目前,预防和治疗糖尿病的药物主要为化学降糖药物(磺脲类、格列奈类、双胍类、α-葡萄糖苷酶抑制剂等)[2],见效快,但长期服用会产生一定毒副作用,导致机体胰岛素受体敏感性降低,甚至影响肝脏系统的正常运行。另外,高血糖引起的体内氧化应激反应,致使机体内自由基难于清除,自由基在体内蓄积,由于含未配对的电子,所以自由基不稳定,会从邻近的分子(包括脂肪、蛋白质和DNA)上夺取电子,从而处于稳定的状态,使得机体内蛋白质、脂肪和 DNA 等生物大分子受到损害,细胞结构遭到破坏,影响机体平衡[3]。自由基与机体的许多功能障碍和疾病的发生密切相关,是糖尿病并发症产生的重要因素,因此,清除体内自由基也是预防糖尿病并发症的途径之一[4]。故寻找更为安全、无毒副作用、经济的天然降血糖药物及抗氧化剂迫在眉睫。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

不同来源青钱柳样品 均为原产地商家提供,经贵州师范大学生命科学学院刘映良教授鉴定为胡桃科青钱柳属植物青钱柳(Cyclocaryapaliurus)茶叶,样品存放于贵州师范大学生命科学学院1509植物化学研究实验室,样品详细信息(见表1);1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH),α-葡萄糖苷酶,对硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷(PNPG) Sigma公司;葡萄糖 天津市鲁鑫化工科技有限公司;抗坏血酸 青岛贺阳化玻有限公司;三羟甲基氨基甲烷(Tris) 南京化学试剂总厂;硫酸亚铁 济宁宏明化学试剂有限公司;30%双氧水溶液 天津市东丽区华明街北于堡工业小区;盐酸 广西浙创化工有限公司;连苯三酚 湖南洪江棓雅生物科技有限公司;水杨酸 成都联禾化工医药有限责任公司;EDTA 重庆化学试剂总厂;甲醇 天津市恒兴化学试剂制造有限公司;以上试剂 均为分析纯。

表1 样品来源信息Table 1 The information of sample source

UV759CRT紫外可见分光光度计 上海佑科仪器仪表有限公司;电子恒温水浴锅 上海宜昌仪表纱筛厂;EYELAN1001旋转蒸发仪 BIOGEN倍捷科技;101-2AB型电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司;CXP-100型多功能粉碎机 上海市晟喜制药机械有限公司;MS105DU型电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司;TD6离心机 长沙湘智离心机仪器有限公司;精密pH仪 上海精科雷磁仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 青钱柳多糖的提取 参照谢建华[21]的方法稍作调整,精准称取各青钱柳样品5.000 g,石油醚脱脂脱色2 h后,加80%乙醇溶液90 ℃水浴回流2 h,过滤挥干,滤渣加100 mL蒸馏水沸水浴提取2 h,减压浓缩成浸膏,蒸馏水定容于25 mL容量瓶,4 ℃冰箱保存待用。

1.2.2 多糖标准曲线的绘制 以葡萄糖为标准品,精密称取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖标准品 105 mg,蒸馏水定容于100 mL容量瓶中,配制成1.05 mg/mL的葡萄糖标准溶液。精密吸取0、1、2、4、6、8、10 mL于100 mL容量瓶中,蒸馏水定容,分别取2 mL于具塞试管中,加入5%的标准苯酚溶液 1.0 mL,混匀,迅速加入浓硫酸 5.0 mL,摇匀,放入沸水浴中加热20 min,取出自来水冷却至室温,于488 nm 处测定吸光度,2 mL蒸馏水重复以上操作为对照,以多糖浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制标准曲线,得出曲线方程:Y=14.642X-0.0768,R2=0.999。

1.2.3 多糖含量测定 精密量取各多糖提取液,稀释至实验所需浓度,按照 1.2.2方法测定,按下式计算样品中多糖含量。

式中:C:由回归方程得出的多糖浓度(mg/mL);N:稀释因数(mL);M:多糖提取物的质量(mg)。

1.2.4 DPPH·自由基清除能力的测定 参照文献[22],精密吸取 2.0 mL DPPH·甲醇溶液(0.068 mg/mL)与 2.0 mL甲醇溶液混合,暗室放置30 min,于517 nm测量吸光值(A1),以2.0 mL不同浓度(0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL)多糖或VC,与等体积甲醇溶液混合,暗室放置30 min,于517 nm测量吸光值(A2),以2.0 mL不同浓度多糖或 VC溶液,与等体积的 DPPH·甲醇溶液混合,暗室放置30 min,于517 nm测量吸光值(A3)。

1.2.5 ·OH自由基清除能力的测定 参照文献[23],依次向试管中加入2.0 mL 6 mmol/L FeSO4溶液,2.0 mL不同浓度的多糖或VC溶液,2.0 mL 6 mmol/L双氧水溶液,摇匀,静置10 min后,再加入等体积6 mmol/L水杨酸溶液,混匀,静置 30 min,于510 nm处测定吸光值A样品,以蒸馏水代替水杨酸溶液,测定A对照,以蒸馏水代替多糖溶液,测定A空白。

1.2.7α-葡萄糖苷酶抑制活性测定 参照文献[25]的方法略调整,样品项:以PNPG为底物,取0.2 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(pH=6.8)于试管中,加入0.2 mL各多糖提取液,摇匀,再加入0.2 mL 0.5 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液,在37 ℃恒温水浴锅中反应15 min后加5 mL 0.1 mol/L Na2CO3溶液终止反应,在400 nm处测定吸光值A样。空白项:以PNPG为底物,取0.2 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(pH=6.8)于试管中,加入0.2 mL 0.5 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液,在37 ℃恒温水浴锅中反应15 min后,加5.0 mL 0.1 mol/L Na2CO3溶液终止反应,在400 nm处测定吸光值A空。背景项:以PNPG为底物,取0.2 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(pH=6.8)于试管中,加入0.2 mL各多糖提取液,在37 ℃恒温水浴锅中反应15 min后,加5.0 mL 0.1 mol/L Na2CO3溶液终止反应,在400 nm处测定吸光值A背。

1.3 数据处理

实验数据均按照对应的公式计算,平行测定三次(n=3),所得结果以平均值±标准误表示,分别采用 Excel、Origin 9.0 和SPSS软件对实验数据列表作图。不同小写字母表示不同产地之间在0.05水平存在显著差异,*表示在0.05水平上显著相关。

2 结果与分析

2.1 不同产地青钱柳的多糖含量及差异性

由表2可知,各产地青钱柳多糖含量介于(3.50%±0.10%)～(5.85%±0.02%),其中,江西修水县含量最高,为5.85%±0.02%,湖南绥宁黄桑坪乡次之,为5.48%±0.10%,贵州榕江县平阳乡最低,为3.50%±0.10%,不同产地之间青钱柳多糖含量存在显著差异(p<0.05)。分析其原因可能是“性从地变,质与物迁”,不同产地因地理环境、气候条件、生态系统等因素的差异,导致不同地区青钱柳多糖含量存在较大差异。

表2 不同产地青钱柳多糖含量Table 2 The content of Cyclocarya paliuruspolysaccharides from different regions

2.2 青钱柳多糖对DPPH·的清除能力

不同产地青钱柳多糖对DPPH·的清除能力如图1所示。研究结果表明,在0.01～2.0 mg/mL实验浓度范围内,青钱柳多糖对DPPH·具有一定的清除能力,且清除率随多糖浓度的增大而增大,呈一定量效关系。当多糖浓度大于0.1 mg/mL时,清除率高于80%,清除能力与VC相当,当多糖浓度低于0.1 mg/mL时,清除率略低于VC。各产地青钱柳多糖对DPPH·清除能力的差异不明显。

图1 青钱柳多糖对DPPH·清除能力Fig.1 Scavenging ability against DPPH ofCyclocarya paliurus polysaccharides

2.3 青钱柳多糖对·OH清除能力

不同产地青钱柳多糖对·OH清除能力如图2所示。图2表明,在0.01～2.0 mg/mL实验浓度范围内,青钱柳多糖对·OH具有一定的清除能力,且随着浓度的增加,清除率也随之增加,呈一定量效关系。但整体而言,青钱柳多糖对·OH的清除率都弱于VC,不同产地青钱柳多糖对·OH的清除能力差异不明显。

图2 青钱柳多糖对·OH的清除能力Fig.2 Scavenging ability against ·OH of Cyclocarya paliurus polysaccharides

2.4 青钱柳多糖对清除能力

图3 青钱柳多糖对的清除能力Fig.3 Scavenging ability of Cyclocarya paliurus polysaccharides control against

2.5 青钱柳多糖对α-葡萄糖苷酶抑制能力

不同产地青钱柳多糖对α-葡萄糖苷酶抑制能力如图4所示。图4表明,在实验浓度范围内,青钱柳多糖对α-葡萄糖苷酶具有一定抑制能力,且随着浓度的增加,抑制能力增强。其中,江西修水县城的青钱柳多糖抑制α-葡萄糖苷酶能力优于对照品阿卡波糖的抑制能力,其余产地样品抑制率均低于阿卡波糖抑制能力。

图4 青钱柳多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制能力Fig.4 Inhibiting ability of Cyclocarya paliurus polysaccharides control against alpha glucosidase

2.6 青钱柳多糖对各模型的IC50值及相关性分析

表3 青钱柳多糖对各模型的IC50值Table 3 The IC50value of Cyclocarya paliurus polysaccharide to each model

3 结论