黑果枸杞花色苷对部分睡眠剥夺大鼠心肌损伤的保护作用

温朝玲，刘春红，孙雯雯，汪 洋

(1．安徽中医药高等专科学校 护理系，安徽 芜湖 241000；2.芜湖市第二人民医院 骨外科，安徽 芜湖 241000；3．芜湖市第二人民医院 病理科，安徽 芜湖 241000；4．安徽中医药高等专科学校 医疗系，安徽 芜湖 241000)

黑果枸杞是我国西部特有的药食两用植物，其代表性的营养成分花色苷是从黑果枸杞成熟果实中提取的一种紫红色水溶性色素，属于天然类黄酮类多酚化合物[1]，具有抗氧化、预防心脑血管疾病、增强非特异性免疫和改善记忆力等多种生理活性功能[2]。

部分睡眠剥夺(partial sleep deprivation,PSD)可引起心肌炎、心脏扩大、冠心病等[3]。但是目前关于黑果枸杞花色苷对PSD大鼠心肌损伤的保护研究报道甚少。故本研究通过制备改良多平台PSD大鼠模型，研究黑果枸杞花色苷对PSD模型大鼠心肌损伤标志物含量、抗氧化标志物含量相关指标以及心肌组织病理学改变来探究黑果枸杞花色苷对PSD大鼠心肌损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物 SD大鼠68只，体质量180～220 g，购自南京青龙山动物中心[许可证号：SCXK(苏)2017-0001]。实验过程中室内温度控制在(24±1) ℃，部分睡眠剥夺时间为中午2时 至次日上午8时。

1.2 药物 复方丹参片(国药准字:G17A011)；黑果枸杞花色苷。黑果枸杞花色苷的制备：黑果枸杞花色苷由本校中药实验室自行制备。黑果枸杞购自亳州药材市场，取黑果枸杞成熟果实200 g，粉碎，提取其花色苷用15倍量pH 4的70%乙醇浸提2 h，提取温度为60℃[6]。回流提取3次，水提物经旋蒸浓缩后，吸附，干燥后的暗紫色粉末即为黑果枸杞花色苷类提取物。运用pH示差法测定黑果枸杞提取物中花色苷的含量为57%[4-6]。

1.3 试剂 CK-MB、cTnI测试盒均购于贝克曼库尔特实验系统(苏州)有限公司(批号分别为GC8198、EA8168)。T-AOC、SOD、MDA测试盒购于南京建成生物工程研究所(批号分别为20180111、20180110、20180109)。

1.4 仪器 BX43普通光学显微镜及显微照相机(Olympus公司)，组织匀浆机(德国IKA T10)；Anthos Zenyth 200 酶标仪(安图生物)；RE-5298A型旋转蒸发仪(西安禾普生物科技有限公司)；1-14K台式冷冻离心机(德国Sigma公司)；贝克曼库尔特AU5800全自动血细胞生化分析仪。

1.5 实验方法

1.5.1 动物分组及给药 60只SD大鼠随机分为：正常对照组(N组)、PSD模型组(M组)、复方丹参片对照组(CDT组)、PSD+黑果枸杞花色苷低剂量组(LrM-L组)，PSD+黑果枸杞花色苷中剂量组(LrM-M组)，PSD+黑果枸杞花色苷高剂量组(LrM-H组)6组，每组10只。6组大鼠均每天灌胃1次，LrM-L、LrM-M、LrM-H分别灌服黑果枸杞花色苷0.25、0.5、1.5 g/(L·kg·d)；正常对照组(给予等体积的0.9%NaCl)、PSD模型组(给予等体积的0.9%NaCl)、复方丹参片对照组[复方丹参片0.32 g/(L·kg·d)]。PSD 4组大鼠均每天睡眠剥夺18 h，共持续21 d。

1.5.2 大鼠PSD模型建立 采用改良多平台大鼠睡眠剥夺法建立大鼠PSD 模型[7-8]，大鼠睡眠剥夺箱设计成长方体(105 cm ×60 cm ×65 cm 的有机玻璃做成)，箱内设置15个直径6.5 cm,高10.0 cm的小平台,小平台之间间隔为15 cm。每天实验开始前2 h开始加水，水深约8.5 cm。上面罩有4目的铁丝网。

1.6 血清指标检测 以2.2 mL/kg乌拉坦腹腔注射麻醉，腹主动脉取全血约5 mL并离心(1200 r/min，10 min，4℃)后取血清，按试剂盒采用ELISA法测定血清cTnI、CK-MB 、T-AOC水平。

1.7 心肌组织匀浆制备及SOD、MDA 等指标 取麻醉后大鼠的左心室前壁心肌组织约0.3～0.4 g，用冰的生理盐水洗涤数次。剪碎心肌组织，加入冷的生理盐水2.7～3.6 mL，用IKA T10匀浆器得到10%心肌组织匀浆液。离心(3000 r/min，10 min)后取上清液分装-20℃冻存备用，待测SOD、MDA。

1.8 统计学方法 采用SPSS 12．0 软件进行数据分析，实验数据以均值±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两采用q检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PSD大鼠一般情况观察 在预实验中，前3天有4例大鼠死亡。实验早期，PSD大鼠表现出一定的交感神经亢奋的行为，如活动量增多，体质量减少，少数PSD大鼠在小平台间不停地跳动，进食量增大，对声光的刺激较为敏感。随着睡眠剥夺时间的延长，PSD大鼠则表现为异常地狂躁，进食及饮水量均明显减少，攻击性强[9]。但是LrM-L、LrM-M、LrM-H组、CDT组大鼠的交感神经亢奋的行为较PSD大鼠有改善，LrM-H组除体质量减少行为无明显变化。

2.2 黑果枸杞花色苷对PSD大鼠血清中心肌损伤标志物CK-MB、cTnI及T-AOC含量的影响 与正常组相比，PSD模型组大鼠的CK-MB和cTnI含量升高(P<0.01)但血清T-AOC活力下降(P<0.01)；与PSD模型组相比，CDT对照组的CK-MB和cTnI下降(P<0.05)，LrM-H和LrM-M组的CK-MB和cTnI含量下降(P<0.01、P<0.05)。说明黑果枸杞花色苷的高剂量能改善PSD所致的大鼠血清中心肌损伤标志性酶的异常升高。

与正常组相比，PSD模型组血清T-AOC活力下降(P<0.01)；与PSD模型组相比，黑果枸杞花色苷(LrM-L、LrM-M、LrM-H)组、CDT对照组升高(P<0.05)。LrM-H和LrM-M组的T-AOC含量升高(P<0.01、P<0.05)；LrM-L组和CDT组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 黑果枸杞花色苷对大鼠血清心肌损伤标志物CK-MB、cTnI、及T-AOC含量的影响

组别CK-MB/(U/L)cTnI/(μg/L)T-AOC/(U/L)N组650.33±57.831.05±0.199.87±3.0M组1717.35±287.40▲1.88±0.22▲6.50±2.3▲CDT组910.75±183.56◆◆1.42±0.18◆7.18±1.8◆LrM-L组1253.62±147.38◆◆1.50±0.23◆7.12±1.2◆LrM-M组1087.5±148.36◆◆1.40±0.20◆7.81±1.4◆◆LrM-H组874.45±163.75◆◆1.28±0.17◆◆8.91±1.5◆◆F36.9314.564.27P0.0000.0000.002

注：与正常组比较，▲P<0.01,与模型组比较，◆◆P<0.01,◆P<0.05。

2.3 黑果枸杞花色苷对PSD大鼠心肌SOD及MDA活性的影响 与正常组比较，PSD组的心肌SOD含量降低(P<0.05)；与PSD组对比，CDT对照组(P<0.05)、黑果枸杞花色苷各组升高(LrM-L组P<0.05，LrM-M组P<0.05，LrM-H组P<0.01),且LrM-H组(P<0.01)、LrM-M组(P<0.05)高于LrM-L组、LrM-L、LrM-M、LrM-H组血清SOD的活性随剂量的增加而递增。

与正常组比较，PSD组MDA含量升高(P<0.05)，与PSD组对比，CDT对照组(P<0.05)、黑果枸杞花色苷各组的心肌MDA降低(LrM-L组P<0.05，LrM-M组P<0.05，LrM-H组P<0.01),且LrM-H组(P<0.01)、LrM-M组(P<0.05)低于LrM-L组，LrM-L、LrM-M、LrM-H组血清MDA的活性随剂量的增加而递减。LrM-H组心肌SOD活性MDA含量要优于CDT组。见表2。

2.4 各组大鼠心肌组织病理学比较PSD模型组大鼠的心肌细胞排列松散，见心肌纤维化程度不一、细胞水肿和炎性细胞浸润；和模型组相比，黑果枸杞花色苷各剂量组PSD大鼠心肌病理性改变有由重到轻的演变，以黑果枸杞花色苷高剂量组改善尤为显著。说明黑果枸杞高剂量组和复方丹参片组均可减轻心室重构，改善睡眠剥夺所造成的心肌细胞纤维化，对心肌细胞的损伤有保护作用。见图1。

表2 黑果枸杞花色苷对大鼠心肌SOD及MDA含量的影响

组别SOD/(U/mgprot)MDA/(nmol/mgprot)N组238.5±11.302.19±0.14M组142.23±8.35▲4.24±0.17▲CDT组179.5±13.21◆1.69±0.11◆◆LrM-L组175.53±9.25◆1.50±0.16◆LrM-M组189.46±8.28◆◆1.62±0.14◆◆LrM-H组204.17±11.91◆◆1.82±0.15◆◆F136.08526.13P0.0000.000

注：与正常组比较，▲P<0.01,与模型组比较，◆◆P<0.01,◆P<0.05。

A．N组；B.M组；C.LrM-L组；D.LrM-M组；E.LrM-H组；F.CDT组。

图1 各组大鼠心肌病理学改变(HE，×400)

3 讨论

人类生命的1/3时间是在睡眠中度过的。在我国约45.4%的人存在不同程度的睡眠剥夺问题[10]。昼夜节律是普遍存在于生物界的一种生理现象[11-12]。Everson等[13]研究表明,睡眠剥夺是一种氧化应激模型，影响了机体的昼夜节律并通过多靶点、多路径诱发机体的氧化应激反应。PSD作为强烈的应激源，在高水平儿茶酚胺和糖皮质激素作用下,机体自由基产生和清除失衡,引发广泛的损伤效应，引起心血管炎症反应[3]。PSD降低心肌细胞抗氧化酶(SOD、CAT)的活性，伴有心肌细胞损伤标志物(CK-MB、cTnI)过度表达；T-AOC水平能够反映机体整体抗氧化能力[14]，MDA含量水平能够直接反映机体过氧化损伤程度[15]。

本研究采用PSD大鼠来模拟成人的睡眠障碍，通过观察各组大鼠一般情况，检测血清和心肌组织中氧化及抗氧化指标，分析心肌病理学变化来探讨黑果枸杞花色苷对PSD大鼠心肌损伤的保护作用。从以上的实验结果可知黑果枸杞花色苷对PSD大鼠心肌损伤具有保护作用，呈剂量依赖性。LrM-H组消减氧化自由基的能力优于CDT组，未发现重要脏器的损害现象。其机制可能与黑果枸杞中的花色苷成分在部分睡眠剥夺过程中稳定心肌细胞的细胞膜，延缓或抑制心肌细胞在急性应激损害的过程中释放炎性介质物所引发的心肌损害，稳定机体睡眠剥夺所引起的氧化应激、降低自由基水平有关，其确切机制有待进一步研究。