聚合酶链式反应方法检测豆制品中转基因成分的研究概述

孟 静，任易婕，孙潇慧，钟丽霞，霍胜楠

（山东省食品药品检验研究院，山东 济南 250101）

1 转基因大豆的概述

大豆作为主要的粮食作物和油品原料，不管在农业发达还是不发达地区，种植面积都占有较大的比例。早期主要依靠农药来对抗植物病虫害，提高产量，随着科学技术的发展，转基因作物发展迅猛，尤其是转基因大豆，抗病虫害、抗除草剂等外源基因的表达在种植方面的优势使得大豆的种植面积和产量有了重大突破，2017年大豆产量3.34亿t，这在很大程度上依赖于转基因技术。

2017年我国大豆进口量达到9 500多万t，占全球大豆贸易量的70%左右，已是世界第一大豆进口国。全球最大的大豆出口国—美国的转基因大豆种植比例为95%，阿根廷、巴西几乎全部种植转基因大豆。所以在全球大豆贸易中，主要是转基因大豆。国内市场大豆主要用于两方面：一是饲料豆粕及初级加工食品原料，二是食用豆油。中国人口众多，满足民众的消费需求是大豆进口的主要原因。大豆含有丰富的优质植物蛋白，可制作成深受人们喜爱的各种菜肴，除食品外，大豆还广泛地应用于医药、化工等领域。杨永存等[1]调查了2012-2015年深圳市售大豆中转基因大豆的销售及标识情况，转基因阳性率为6.71%。黄靖等[2]在广州抽取的豆制品，转基因检出率超过50%，但在其产品上未进行有效标识。孟彦辰等[3]调查了转基因标识制度、现状及存在的缺陷，指出我国目前需要制定的一系列转基相关法律制度。

我国先后发布了《中华人民共和国种子法》、《农业转基因生物安全管理条例》、《农业转基因生物标识管理办法》等相关法律法规，对转基因产品的进口、种植、使用、监管作出了明确的体系要求。进口用做加工原料的农业转基因生物，不得改变用途，目前我国除转基因棉花和番木瓜的种植外，没有批准其他转基因粮食作物种子在中国境内种植。农业部有关负责人表示，我国对转基因工作的要求是明确的，即研究上要大胆，坚持自主创新；推广上要慎重，做到确保安全；管理上要严格，坚持依法监管。2017年中央1号文件强调，要“加强农业转基因技术研发和监管，在确保安全的基础上慎重推广”。

2 豆制品转基因的检测

目前，国内外转基因产品检验方法主要有两种，第一种是以核酸为检测目标物的方法[4]；第二种是以特定的表达蛋白为目标物的检测方法，包括蛋白质单向电泳、双向电泳、Western杂交分析及酶联免疫分析技术[5]。核酸检测是研究最多、应用最为广泛的，包括聚合酶链式反应（poly-merase chain reaction，PCR）、探针杂交法等，所有这些应用都是以从样本中提取脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）为整个检测的基础，而食品原料经过不同方式处理，成品中DNA片段的大小也不尽相同。

我国豆制品的加工工艺主要包括高温蒸煮、磨粉成浆、压榨、发酵抽提等，不同的加工方式对基因组的影响不同。根据对核酸的破坏和保留程度，加工方式分为初级加工和深加工，初级加工有磨粉、高温蒸煮等，压榨和发酵抽提则属于深加工方式。TIAN F等[6]研究了不同温度对豆制品中核酸的破坏程度，发现温度越高，DNA破坏程度越大；陈颖等[7]发现物理过程（如磨浆、高温加热）可使DNA片段降解一半甚至更多；王超等[8-9]调查了豆粉、豆干、豆腐、豆浆和腐竹等6种产品的转基因情况，样品均提取到了高质量的基因组DNA，建立了稳定的实时定量荧光聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）扩增体系；王卫国等[10]研究了微波和高压对大豆转基因成分的影响，结果表明微波处理的样品核酸降解比较彻底。以上实验表明，初级的加工方式对核酸的影响不大。而压榨、抽提等深加工方式对产品中核酸的保留程度有很大的影响，李允静等[11]论述了植物油的转基因成分检测技术的研究进展，针对植物油中核酸含量低、片段短的现状，提出了缩短检测靶标开展食用植物油中转基因成分检测是今后研究的一个方向；核酸的质量是整个PCR检测的基础，针对深加工产品，各个研究小组也提出了不同的前处理方法来获取高质量的DNA，SN/T 2705—2010《调味品中转基因植物成分实时荧光PCR定性检测方法》中对调味品的前处理采用了十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyl trimethyl ammoniumbromide，CTAB）处理和低温差速离心的方法[12]，得到了可用于PCR检测的DNA；程红梅等[13]研制了离心柱法提取大豆油中DNA，可以从10mL油中提取出0.4μg DNA；栾凤侠等[14]比较了CTAB方法及改良试剂盒方法在提取油脂中DNA的效果，推出了适用于实时荧光定量PCR扩增检测的提取试剂盒。目前大豆油及调味品中的大豆转基因成分的检测做了较多的研究，刘锦鹤等[15]利用硅膜吸附柱法来富集提取大豆油中的DNA，PCR扩增后能够得到清晰的目的基因条带，在7个样品中检出了外源基因；张娟等[16]以CTAB法为基础进行DNA提取方法的优化，所建立的方法在样品的检测中可以有效检出内源基因；张文志等[17]设计了荧光定量PCR的探针来检测酱油中外源基因，建立了逆转录PCR（reversetranscription PCR，RT-PCR）的方法检测大豆成分。

这些样品的前处理方法较为成熟，在食品安全国家标准的制定过程中，制定单位可验证并采用这些研究成果，完善国家食品安全标准，为食品转基因检测及监督提供技术保障。

3 现行转基因大豆的检测及标准的概况

已经有众多学者利用酶联免疫吸附法[18-19]、色谱法[20-21]、芯片法[22-24]、光谱法[25]、核酸检测法[5-7]等开展大豆制品的转基因成分检测的研究，形成国家检测标准且应用广泛的是核酸检测方法，经检索，我国已发布大豆及其制品转基因成分检测的方法主要有农业部公告16项，行业标准12项，农业部标准5项，转基因检测实验室通用的国家标准8项、农业部公告1项、行业标准1项，另外还有部分地方标准等。检测标准中均为定性检测，转基因通用的国家标准中对实验室的布局、样品的制备、核酸的提取和PCR体系、实验过程的质量控制和结果的判断表述都作了较为详细的说明，转基因产品检测实验室的建设和日常的检测工作都应遵循这些标准。各检测方法都有其自身的适用范围，实验室可根据检测样品及检测环境条件进行选择实验，常用检测方法的优缺点比较见表1。

表1 常用检测方法的优缺点比较Table 1 Comparison of the advantages and disadvantages of commonly used detection methods

检测方法标准主要是农业部的1485、1782、2031、2122、2259号公告及行业标准，内源基因选用了大豆凝集素Lectin基因，外源基因则是通过检测耐除草剂、抗虫和品质改良的转化体特异序列来判断是否含有转基因成分（如CaMV 35S启动子、NOS终止子等），检测步骤包括：抽样及样品制备、模板的制备纯化、PCR反应、产物检测，对大豆的原料及初级加工产品的转基因检测来说是比较容易，且能取得很好的结果，这都源于模板DNA的获得。植物油、调味品等由于其加工工艺的特殊性，核酸在加工过程中的降解、含量低等特点，使得DNA模板在提取过程中相当困难[39-40]，其他的深加工产品如阿胶DNA的提取也存在类似的问题[41]，同时市场上也推出了相关的试剂盒产品（如EdibleVegetable Oil DNA Extraction Kit等），研究人员对传统方法改进后进行DNA的提取[42]，获得很好的效果。

大豆转基因检测的标准中核酸的扩增检测主要分为普通PCR、荧光定量PCR方法和环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）3种方法。普通PCR在DNA聚合酶的作用下，通过引物与模板DNA的退火延伸，目标片段得到指数扩增，使用凝胶电泳对片段的大小进行检测，回收测序来判断目标序列，属于定性反应。荧光定量PCR则是在PCR的基础上通过荧光探针或荧光染料的加入使得荧光信号的累积与PCR产物形成同步，从而使目标DNA的定量成为可能。

引物的设计是影响PCR实验的重要因素，尤其对DNA含量少、片段小的产品（如油脂类、调味品等），引物的长短、特异性都是关键点，荧光定量PCR在实验完毕后通过Ct值来判断是否含有目标基因，较普通PCR快速方便，是我国在标准或科研中使用最多的方法，该技术在探针的设计及检测仪器比较昂贵。环介导等温扩增方法灵敏度高、反应时间短、不需要特殊的仪器、操作简单，同时引物设计和前期开发较复杂，容易造成假阳性，但环介导等温扩增反应不需要PCR仪和昂贵的试剂，有着广泛的应用前景，容易在基层检测机构推广，目前仅在原料的转基因检测方面有应用[43]。

4 讨论与建议

我国按照全球公认的评价准则并结合国情，建立了涵盖1个国务院条例、5个部门规章的法律法规体系，覆盖转基因研究、试验、生产、加工、经营、进口许可审批和产品强制标识等各环节，形成了一整套适合我国国情并与国际接轨的法律法规、技术规程和管理体系，为我国农业转基因安全管理提供了有力保障。但在转基因检测领域，大豆产品转基因检测的标准较多，检测基因不同，相互之间存在不统一，在这里提出几个在实验过程中的问题，以期给现阶段正在进行的标准整合工作提供一定的参考。

模板DNA浓度和纯度：农业部发布的转基因大豆检测公告（以下简称“公告”）中对于模板DNA的浓度都给出了明确的说明，即PCR反应管中的终质量浓度为2mg/L，在行业标准中对DNA的浓度给定了一个范围，在方法验证过程中需根据仪器的检出限等特点自行实验。模板的浓度和纯度对痕量目的基因的检测来说是较为重要的，紫外分光光度计除给出浓度外，A260nm/A280nm的比值用于评估样品的纯度，在实验中应对这两点进行关注，需要质控样品进行质量控制。

循环次数：公告中PCR反应的循环次数统一为35次，行业标准中为40次。PCR反应体系中的酶和底物在最初的循环中，快速的结合扩增，扩增曲线呈现S型，循环次数过多，产物间可能会形成较为复杂的结构，模板的特异性降低，可能会形成非特异性扩增，给后续的检测带来误差，因此循环次数不是越多越好，如果Ct值为35～40，实验人员需要重复实验进行确认，生产加工过程中多个生产线上产品之间的交叉所带来的痕量DNA对结果的判定存在干扰，标准制定应对此明确。

PCR产物的检测：定性PCR方法中，产物的检测使用了琼脂糖凝胶电泳来分离判断片段大小，由于样品中残留的核酸片段小、含量少、扩增效率不高，结果判定时比较依赖检验人员的经验。荧光定量PCR和毛细管凝胶电泳的引入在很大程度上可以弥补定性检测的缺陷，但仪器价格昂贵，很难普遍推广，特别是基层监管机构。

标准物质的获取：GB/T 19595.2—2004《转基因产品检测实验室技术要求》中要求检验过程应设置实验室环境对照、阴性质控、阳性质控和PCR抑制物对照来作为实验室转基因检测体系的质量控制手段，阴性质控包括核酸提取空白对照、PCR扩增试剂对照和阴性目标DNA对照，阳性质控包括阳性提取对照、阳性目标DNA对照和弱阳性目标序列对照[31]，这里提到的阴性目标DNA对照和阳性质控都属于标准物质，它的使用是转基因产品检测结果有效的重要保证。按是否需要认证分为基准标准物质、普通标准物质和工作标准物质，有证标准物质是基准标准物质，可以溯源到有证标准物质的是普通标准物质，正常使用和消耗的主要是工作标准物质。在正常监管工作中转基因生物定性检测主要采用工作标准物质作为阴性和阳性对照，转基因生物定量检测可以采用普通标准物质进行。标准物质有4种形态：种子、粉末、目标DNA和质粒，这4种形态各有优劣，市场上能够提供的品系种类有限，大部分实验室使用的是代代相传的种子。目前农业部科技发展中心负责研制的标准物质已经面向市场提供，标准物质的规范化生产和监管体系的完善指日可待。

5 总结与展望

中国是转基因生物及其制品的巨大市场，而豆制品又居于首位，随着生物技术的迅速发展，除抗除草剂品种外，将会有更多的品种出现。转基因产品可以增加产量，解决食品短缺问题，还可以增加食品的种类，改进食品的营养成分，增加作物的抗虫害、耐严寒、抗高温、耐盐碱、抗倒伏的能力。同时也给转基因生物安全监管和检测提出了更为严峻的问题。为适应转基因产品的快速发展，要构建标识和检测标准监管体系，以统一、有效、协调、时效性为原则，开展对标准体系的评价、确认和改进，进一步完善标准体系，为保障食品安全做好技术支撑。