超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用法分析罗非鱼中抗生素残留

贾 玮，张焱茜，邹 力，樊 成，陈雪峰，储晓刚, 3

(1.陕西科技大学 食品与生物工程学院，陕西 西安 710021; 2.陕西省产品质量监督检验研究院，陕西 西安 710048; 3.中国检验检疫科学研究院，北京 100123)

0 引言

抗生素是世界上用量最大、使用范围最广的药物之一，在畜牧业、养殖业中应用广泛，全球抗生素的年均使用总量约为200 000吨[1-3].在渔业养殖中，抗生素主要用于促进动物生长、疾病的预防和治疗.若使用不规范，会在动物源性食品中产生药物残留[4-7].抗生素按其化学结构可分为β-内酰胺类、喹诺酮类、四环素类、氨基糖苷类、大环内酯类、磺胺类等[8].而国内目前关于抗生素类药物残留的研究多限于同类药物的测定[9-12].

罗非鱼为主要养殖鱼类，含有多种不饱和脂肪酸和丰富的蛋白质，被誉为“不需要蛋白质的蛋白源”[13,14].基于此，本课题以罗非鱼为研究对象，预建立同时测定罗非鱼中4类9种抗生素药物残留的筛查方法，旨在为监控渔业养殖中抗生素多残留提供技术支持，为食品安全监管提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇、乙腈、甲酸(色谱纯),德国Merck公司；恩诺沙星、达氟沙星、四环素、土霉素、金霉素、强力霉素、氯霉素、氟苯尼考及甲砜霉素(纯度均大于95%),德国Dr.Erenstofer公司；无水硫酸镁、无水硫酸钠、无水乙酸钠、氯化钠、柠檬酸、磷酸氢二钠,德国Sigma公司；C18、PSA,美国Welch公司.

1.2 仪器与设备

安捷伦6550 iFunnel Q-TOF四级杆质谱仪，配有安捷伦1260型高效液相色谱仪及电喷雾离子源,美国Agilent Technologies公司；Milli Q 超纯水系统,美国Millipore公司；TG16-WS台式高速离心机,湘仪离心机仪器有限公司；数显涡旋混合器,美国Fisher Scientific公司.

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

称取适量标准品，分别用甲醇配制成100μg/mL的标准储备液，置于-20 ℃待用.实验中根据需要配制不同浓度的系列标准工作液，现用现配.

1.3.2 样品前处理

称取1.0 g经均质的样品(精确至0.01 g)于聚四氟乙烯离心管中，加入2.5 mL甲醇，采用酸化乙腈溶液(乙腈∶水∶乙酸=84∶15∶1,v/v)定容至12.5 mL，再加入2.5 mL 0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine(pH=4.0)，震荡涡旋；加入无水硫酸镁1.0 g、乙酸钠1.5 g及氯化钠1.9 g，震荡涡旋，于8 000 r/min离心10 min；取上清液至试管中，加入C18 0.4 g、PSA 0.4 g及0.1 g无水硫酸钠，涡旋震荡，离心，分别取上清液及下清液，经0.22μm滤膜过滤后，上机测定.

1.3.3 高效液相色谱-串联质谱条件

色谱柱：Thermo Hypersil GOLD AQ 柱(100 mm×4.6 mm，5 mm)；柱温：35 ℃；流动相A为水+0.20 %甲酸+4.00 mmol/L甲酸铵，B为甲醇+0.20%甲酸+4.00 mmol/L甲酸铵；梯度洗脱程序：0.00～1.00 min，100% A，1.00～7.00 min，100%～0% A，7.00～9.00 min，0% A，9.00～11.00 min，0%～100% A，11.00～15.00 min，100% A；流速：0.30 mL/min；进样量：10.00μL.

质谱条件：采用电喷雾离子源(ESI+及ESI-)；毛细管电压4.00 kV(ESI-为3.50 kV)，喷嘴电压1.00 kV；干燥气温度280.00 ℃；干燥气流量13.00 L/min；雾化气压力20.00 psig；鞘气温度350.00 ℃；鞘气流量12.00 L/min.

2 结果与讨论

2.1 超高效液相色谱-串联质谱条件的选择

本研究考察正、负两种离子模式测定9种目标化合物的响应特点.沙星类及四环素类6种化合物在正模式下具有较强的响应；氯霉素类3种化合物在负模式下具有较强的响应.通过优化离子源参数，确认分子离子峰，并进行二级质谱分析，得到分子离子、碎裂离子及最佳碰撞能量等信息，如表1所示.

考察了甲醇-水和酸化甲醇-水(0.2%甲酸+4 mmol/L甲酸铵)两种流动相体系对分离效果的影响.结果表明，酸化甲醇-水溶液作为流动相可有效分离9种目标化合物，且峰形良好.其中，四环素及强力霉素作为同分异构体也能达到良好的分离，如图1及图2所示；采用甲醇-水流动相体系时，四环素、土霉素、金霉素及强力霉素不能有效成峰，如图3所示.酸性缓冲液作为流动相能增强灵敏度、提高目标化合物的离子化效率、增强响应强度，这主要是由于酸提供了更佳的质子化环境[15].但酸性过强易缩短色谱柱寿命，故本研究选择0.2%甲酸+4 mmol/L甲酸铵来调节流动相的pH.

图1 ESI+条件下6种抗生素的离子流图

表1 9种抗生素的质谱采集参数

图2 ESI-条件下3种抗生素的离子流图

图3 以甲醇-水作为流动相时四环素类物质的离子流图

2.2 提取溶剂的选择

9种抗生素均含有极性基团，根据相似相溶原理，更易溶解于极性有机溶剂中.乙腈为抗生素多残留检测最常用的提取溶剂，然而采用纯乙腈提取无法兼顾极性大的抗生素，通过加入水相调整提取液极性可提取到不同极性的目标物质；此外，四环素类化合物中所含的氨基基团在酸性条件下带正电荷且易溶于水，故初步选择酸化乙腈溶液(乙腈∶水∶乙酸=84∶15∶1,v/v)作为提取剂.结果显示，喹诺酮类及氯霉素类抗生素能得到有效提取，而四环素类化合物在该溶剂的作用下大量损失.考虑到四环素类化合物的结构属于氢化并四苯环衍生物，其C10酚羟基和C12烯醇基能与金属离子如Ca2+、Mg2+形成络合物沉淀[16].罗非鱼基质含有一定量的Ca2+及Mg2+，同时因无水硫酸镁作为盐析剂引入了大量Mg2+，导致四环素类化合物与Ca2+、Mg2+络合沉淀，无法萃取至乙腈层中，故在提取过程中引入0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine溶液，采用EDTA螯合溶液中的Ca2+和Mg2+，释放四环素类化合物进入溶液参与萃取过程.

当引入Na2EDTA-Mcllvaine溶液后样液出现分层现象.过程中观察到下层液体相比于上层液体，溶液混浊且体积较小，因此，本研究于前处理初期，在样品中引入2.5 mL甲醇.结果显示经甲醇、酸化乙腈及Na2EDTA-Mcllvaine三种溶剂综合提取后，再配合无水硫酸镁、C18、PSA等净化剂的作用，有效沉淀了样品基质中的蛋白质、脂肪、色素等物质，增强了净化效果.取上下清液分别上机检测，氯霉素类3种物质在上清液中回收率良好，喹诺酮类及四环素类6种物质在下清液中回收率相对较高(<80 %)，四环素类4种物质的回收率得到明显改善,如图4所示.

图4 4种四环素类物质在不同成分提取剂下的回收率(n=6)

2.3 方法学验证

2.3.1 基质效应

本研究选取罗非鱼样品考察基质效应.通过计算溶剂标准曲线及基质匹配标准曲线的比值进行评价.采用空白基质样液稀释混合标准溶液至0.75 mg/kg、1.50 mg/kg、2.25 mg/kg、3.00 mg/kg、3.75 mg/kg，与同浓度纯溶剂标准溶液一同上机测定.由于分散固相萃取法可分析的抗生素范围广、净化效果好，为目前抗生素类药物残留分析中最为有效的净化方法，适合多种类药物的同时分析[17].故在前处理中，采用分散固相萃取法净化基质，降低基质效应，并结合基质匹配标准校正法，最大限度消除基质效应对准确性的影响.从表2可知，空白罗非鱼基质的9种抗生素药物的基质效应值在0.84～1.17范围内，基质效应较弱，以恩诺沙星为例，如图5所示.

图5 以溶剂标准曲线及基质匹配标准曲线的比值考察恩诺沙星基质效应

2.3.2 线性范围与检出限

在空白样品中添加0.75 mg/kg、1.50 mg/kg、2.25 mg/kg、3.00 mg/kg、3.75 mg/kg系列水平的混合标准溶液，按前处理方法处理后上机测定.以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制基质加标工作曲线，得到本方法的线性范围、回归曲线方程及相关系数，如表2所示.结果表明，9种化合物在该范围内线性关系良好，相关系数(R2)均大于0.90.分别以3倍信噪比和10倍信噪比计算罗非鱼中9种抗生素的检出限及定量限，沙星类化合物的检出限和定量限分别为0.31～0.36μg/kg及1.04～1.20μg/kg，四环素类化合物的检出限和定量限分别为10.81～16.37μg/kg及36.04～54.56μg/kg，氯霉素类化合物的检出限和定量限分别为0.55～1.20μg/kg及1.84～4.00μg/kg.

2.3.3 回收率和精密度

取罗非鱼基质空白样品，添加一定量的9种抗生素混合标准溶液，按照1.3.2节所述步骤进行前处理，考察日内、日间精密度.于同一天不同时间点测定3次，每次进行3组平行实验，连续测定3天，结果见表3所示.由表3可知，9种抗生素的平均回收率为78.04%～103.08%，相对标准偏差为1.37%～9.92%，日内和日间RSD范围分别为1.37%～9.86%和3.86%～9.92%，表明所建方法具有良好的精密度.

表2 罗非鱼中9种抗生素的相关技术指标

表3 9种抗生素的日内和日间精密度(n=9)

3 结论

本研究将分散固相萃取法与超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱法联用，建立了准确测定罗非鱼中9种抗生素残留的方法，采用基质匹配标准校正法定量.所建立的方法操作简单、基质干扰少、回收率高、重复性好，可用于罗非鱼中9种抗生素的测定，适合大批量样品的监测分析，从而为食品安全监管提供一定的技术支持.