超高效液相色谱/串联质谱法直接测定地表水中残留的恶喹酸

张 玉，吴佳伦，吴晓峰，李 佳，陈 勇

(1. 彭州市环境监测站，四川 成都 611930; 2. 成都市环境监测中心站，四川 成都 610072)

0 引 言

恶喹酸是一种喹诺酮类杀菌剂，其分子式为C13H11NO5，分子量为261.23。恶喹酸在水中的溶解度为3 μg/L。恶喹酸对真菌无活性，对革兰阳性菌活性较弱，而对革兰阴性菌具有广范围的抗菌活性，其可以在细菌的菌体内，与对于DNA的超卷曲结构导入反向超卷曲的酶的亚组A结合，使其机能受抑制而使DNA无法复制，从而抑制DNA的合成来阻碍病菌分裂和增殖，因此恶喹酸常被应用于防治洋葱球茎软腐病、水稻谷枯细菌病以及多种鱼类疾病[1-3]。但是，在不规范使用的情况下，恶喹酸可能通过雨水冲洗或浇灌，淋溶进入水库、湖泊等水体，并通过食物链进入人体。基于细菌对抗生素耐药性产生的认识以及某些喹诺酮类抗生素，如萘啶酸，显示的致癌、致突变、干扰生殖系统、诱发光过敏等毒性的认识，恶喹酸在水体中的残留对人类及整个生态系统可能构成长期潜在的威胁[4-8]。

目前关于检测恶喹酸残留的报道有很多，主要有高效液相色谱/荧光检测法[9-11]、紫外分光光度法[12]、酶联免疫吸附法[13]和高效液相色谱/串联质谱法。其中，高效液相色谱/串联质谱法，由于具有灵敏度高、应用范围广、抗干扰能力强、操作方法简便快速等优点，而被广泛应用于恶喹酸残留的检测[14-17]。惠欣欣等[1]建立了用高效液相色谱/串联质谱测定洋葱中恶喹酸残留量的快速检测方法；丁涛[18]等使用高效液相色谱/串联质谱法测定蜂蜜中残留的19种喹诺酮类药物；杨方等[19]用高效液相色谱/串联质谱法检测了水产品中15种喹诺酮类药物的残留量。目前使用高效液相色谱/串联质谱法对恶喹酸的测量已涉及食品、化妆品和水产养殖等方面，但对环境地表水中恶喹酸残留的研究尚且不多[20]。由于恶喹酸在地表水中的累积可能会造成本底的增高及耐药性的出现，对环境保护造成巨大的挑战，因此对地表水中恶喹酸残留进行检测具有重要意义。

本文建立高效液相色谱/串联质谱法，对地表水中的恶喹酸残留过滤后直接进行测量。优化了HPLC-MS/MS条件，用多反应监测（MRM）正离子扫描方式进行质谱检测，外标法定量，并对不同溶剂比例、添加剂甲酸的加入和基质效应对恶喹酸的信号影响进行了比较。

1 实验部分

1.1 仪器设备及试剂

Agilent 1290-6460超高效液相色谱/串联质谱仪（美国）；ACQuITY UPLC BEH C18（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）色谱柱；ELGA Purelab ultra Analytical纯水制备装置（英国）。Agilent PTFE-Q（聚四氟乙烯）0.2 μm 针式过滤器。

恶喹酸标准品购于上海西陇生化科技有限公司。甲酸为HPLC级，购于上海安谱公司。甲醇为HPLC级，购于Fisher Chemical公司。实验用水为超纯水 ELGA Purelab ultra Analytical纯水系统制备。

标准储备溶液：称取定量恶喹酸标准物质，用甲醇定容至100 mL，配制成 260 mg/L的标准储备液。然后稀释成13 mg/L的标准中间液，于–20 ℃下避光保存。

1.2 HPLC-MS/MS条件

1.2.1 液相色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）；柱温：30 ℃。

流动相：体积比为15:85的0.1%的甲酸水溶液：甲醇；流量：0.25 mL/min；进样量：2 μL。

1.2.2 三重四级杆质谱条件

参数优化方式为SCAN模式和Productor ion模式，检测方式为多反应监测（MRM）正离子扫描模式；碰撞气为高纯氮气；干燥气温度350 ℃；干燥气流量 13 L/min;雾化器压力 60 psi（1 psi=6.895 kPa）；鞘气温度 400 ℃，鞘气流量12 L/min；毛细管电压（正）2 000 V；喷口电压（正）500 V。

恶喹酸质谱分子参数见表1。

1.3 实验步骤

将地表水过0.2 μm亲水相针式过滤器，去除水样中的杂质后，装入样品瓶中。加入相应量的甲醇和恶喹酸标液，进行HPLC-MS/MS分析。

表1 恶喹酸质谱分子参数1）

2 结果与讨论

2.1 不同溶剂比例对恶喹酸响应的影响

样品的溶剂组成比例对色谱峰影响很大，因此本实验使用不同比例的甲醇-水溶剂配制浓度为7.8 μg/L的恶喹酸溶液，比较恶喹酸的信号响应，结果如图1所示。其中，从1到11，甲醇比例依次为：0%、 10%、 20%、30%、40%、 50%、 60%、 70%、80%、 90%、 100%。在各比例下，恶喹酸的峰形都较好，基线平稳，信噪比高，没有出现峰分裂；但当选用60%、70%、80%、90%的甲醇作为样品溶剂时，恶喹酸的信号响应明显高于溶剂中甲醇比例为0%、10%、20%、30%、40%、50%、100%时。推测该现象可能是恶奎酸的离子化程度与溶解度综合作用的结果：电喷雾离子化过程中，带电液滴表面积减小，表面电荷密度增大，当电荷间静电排斥力超过表面张力时初始液滴发生库伦爆炸产生小液滴，小液滴发生崩散，逐步释放出液滴表面多余的电荷直至释放气相离子，水的表面张力大，使得初始液滴大，爆炸形成小液滴困难，需要较长时间来进行溶剂蒸发，而水的挥发性低导致气相离子释放效率下降；此外，水的高粘度导致离子电泳迁移率低以及水的极性产生的溶剂化作用使得分析物呈中性而不能被检测器识别等原因也可能导致离子化效率下降[21-23]。但恶奎酸25 ℃时在甲醇中的溶解度小于1.0%，在水中的溶解度为0.003 mg/L，因此当溶剂全部为甲醇时，可能会降低恶奎酸的溶解度，导致信号响应降低。所以在后续实验中，将对60%、70%、80%、90%的甲醇作为溶剂进行进一步探讨。

图1 不同溶剂比例对恶喹酸响应的影响

2.2 甲酸对恶喹酸信号响应的影响

在液相色谱的流动相中加入添加剂可以改善色谱分离度，改善峰形，提高电喷雾离子化效率。基于此，本实验进一步探讨了在样品配制时甲酸的加入对恶喹酸响应信号的影响。分别以60%、70%、80%、90% 的甲醇作为样品溶剂，在 2.6，52，78 μg/L 3个浓度水平下，比较加入甲酸（0.1%）与不加甲酸的区别。根据图2中恶喹酸的出峰情况可得出，在相同甲醇比例和相同恶喹酸浓度下，加入甲酸后的响应信号明显低于不加甲酸。出现该现象可能是因为甲酸与恶奎酸在离子化过程中竞争液滴表面过剩电荷，产生了离子抑制现象。故在后续实验中配制样品时均不加入甲酸。

图2 甲酸对恶喹酸信号响应的影响（“+”为加入甲酸；“–”为不加入甲酸）

2.3 基质效应对直接测定恶喹酸信号响应的影响

在HPLC-MS/MS检测中，分析物共流出组分会直接影响电喷雾的离子化效果和检测信号的增强或抑制。为研究地表水的基质效应对直接测定恶喹酸的影响，本实验将超纯水与地表水在甲醇比例分别为 60%、70%、80%、90%时，在 2.6，52，78 µg/L 3个浓度水平上的恶喹酸出峰情况进行对比。结果如图3所示，在相同甲醇比例和相同浓度水平下，均基线平稳、信噪比高、峰形一致、没有出现峰分裂；当甲醇比例为60%和90%时超纯水与所测两种地表水的恶喹酸峰高存在微小差异；当甲醇比例为70%和80%时，峰高基本一致。因此，选择甲醇比例为80%进行后续实验。

图3 基质效应对恶喹酸信号响应的影响

2.4 方法性能指标

2.4.1 标准曲线及方法检出限

在最优条件下，加入恶喹酸标准溶液，配制成浓度为 0.13，0.52，1.04，3.9，7.8，13，26，52，78 µg/L的标准系列。以浓度为横坐标，相对峰面积为纵坐标进行线性拟合，结果如图4所示。在 0.13～78 µg/L 范围内线性良好，线性方程为y=0.595 9x+1.378 8，线性相关系数为r2=0.999 2，方法检出限为0.036 μg/L。线性范围内，各浓度水平均连续进样3次，峰面积相对标准偏差均小于4.3%。

图4 恶喹酸标准曲线

2.4.2 回收率及相对标准偏差

取两种地表水样品，分别添加1.04，3.9 µg/L浓度水平的恶喹酸标准溶液。在最优条件下，每个添加水平平行测定10次，计算其回收率和相对标准偏差，结果见表2。结果表明，该方法准确性高、重现性好，各项指标能够满足残留分析的要求。

表2 两种地表水中恶喹酸的回收率与相对标准偏差（n=10）

2.4.3 样品检测

为验证方法的实用性和准确性，应用该方法对3条河流的地表水共15个样品进行恶喹酸含量的测定。测定结果表明，被测的15个水样均未检出恶喹酸残留。

2.5 恶喹酸的检测方法对比

目前已知的对地表水或废水中的恶喹酸残留进行检测的方法中，大多需要进行固相萃取等前处理过程[24-25]。但前处理过程通常存在操作步骤繁琐，需耗费相对较长时间；使用大量有机溶剂，可能造成环境污染；工作量大，不利于批量检测；操作步骤多，使用试剂多，引入误差的可能性增多，影响回收率的因素多等缺点。因此，设计一个能够快速直接测定样品浓度的方法很有必要。

3 结束语

恶喹酸在地表水中的累积可能会造成本底的增高及耐药性的出现，对环境保护造成巨大的挑战，因此对地表水中恶喹酸残留进行检测具有重要意义。本文建立了超高效液相色谱/串联质谱仪直接测定过滤后的地表水中恶喹酸残留的分析方法。考察了不同溶剂比例下恶喹酸信号响应的差别，得出在一定范围内，甲醇比例越高，恶喹酸峰信号响应越强。比较了甲酸的加入对峰信号的影响，得出在配制样品时加入甲酸会减小峰响应。并讨论了基质效应对恶喹酸检测的作用。在多反应监测正离子扫描方式下，用外标法定量，对影响回收率和重现性的主要因素进行优化，在0.13～78 µg/L范围内进行定量分析，结果线性良好，检出限为0.036 µg/L。该方法准确、简单、快速、重现性好，适用于直接测定过滤后地表水中恶喹酸的残留。该方法可以对环境监测领域地表水中恶喹酸的检测提供有用信息。接下来将对采用HPLC-MS/MS同时直接测定地表水中多种抗生素的方法进行进一步研究。