美洲大蠊精粉对小鼠血糖和肌酐的影响

高洁， 刘瑾华， 孙晓红， 刘诗尧， 沈咏梅， 张修月， 岳碧松*

(1.四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都610065； 2.药用美洲大蠊四川省重点实验室，成都610031)

美洲大蠊Periplanetaamericana属昆虫纲Insecta蜚蠊科Blattidae大蠊属Periplaneta。近年来，美洲大蠊及其提取物因在促组织修复、抗肿瘤、抗氧化和抗菌抗病毒以及保护心血管、肝脏、脾和胸腺等方面的作用而受到关注，由美洲大蠊提取物为原料制成的相关上市药品如康复新液、心脉隆和肝龙胶囊等在临床上广泛应用，且效果显著(林喆等，2017)。另外，美洲大蠊全基因组测序的完成为探究其药用分子作用机理打下基础(晋家正等，2018)。

长期高脂饮食易引起血脂水平升高，造成高血脂症、肥胖症、心脑血管疾病等，与糖尿病和高血压等密切相关，对心、肝、肾等器官造成损伤(苏蓉，于德水，2009；崔立坤，2011；王瑾等，2016)。赖泳等(2012)研究表明，美洲大蠊提取物可降低糖尿病小鼠的血糖水平，并能减轻糖尿病小鼠体质量降低、多饮、多食的症状。本实验首次探讨了美洲大蠊精粉对长期高脂膳食小鼠血糖和肌酐的影响，并对其降血糖和保护肾脏的作用机理进行了初步探讨，为美洲大蠊在预防和治疗糖尿病以及保护肾脏等方面的潜在价值提供一定的研究思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物和饲料

体质量18～20 g的SPF级雄性昆明小鼠，实验动物生产许可证号：SCXK(川)2015-030，实验动物使用许可证号：SYXK(川)2014-189，购自成都达硕实验动物有限公司，按照屏障系统设施要求进行饲养环境管理。高脂饲料(基础饲料中添加10%猪油、2%胆固醇和1%胆酸钠等)购自成都达硕实验动物有限公司。

1.2 药品、试剂和仪器

美洲大蠊精粉(批号：170201)由四川好医生攀西药业有限责任公司提供；葡萄糖和肌酐测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；动物总RNA提取试剂盒购自福际公司；反转录试剂盒和2×Taq SYBR Green qPCR Mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司；Multiskan GO全波长酶标仪(Thermo Scientific)；荧光定量PCR仪(Bio-Rad)。

1.3 分组和给药

室温18～22 ℃，光照12 h昼夜交换。40只小鼠适应性喂养1周后禁食12 h，随机分为对照组和实验组(低剂量组：100 mg·kg-1，中剂量组：200 mg·kg-1和高剂量组：400 mg·kg-1)，每组10只，且起始平均体质量尽量保持一致。对照组给予0.2 mL生理盐水，实验组给予0.2 mL不同剂量的美洲大蠊精粉混悬液，每天灌胃1次，连续灌胃49 d，所有小鼠均以高脂饲料喂养，观察和记录小鼠的体质量和摄食量。灌胃第42天和第49天禁食12 h后，每组随机抽取5只小鼠取血及解剖获得肝脏和肾脏。

1.4 血清葡萄糖和肌酐检测

心脏取血，室温静置后，3 600 r·min-1离心10 min，取血清，用试剂盒检测血清葡萄糖(葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法)和肌酐(肌氨酸氧化酶法)含量。

1.5 实时荧光定量PCR

小鼠的肝脏和肾脏在液氮中速冻后放入-80 ℃冰箱保存备用。按照说明书分别用组织总RNA提取试剂盒和反转录试剂盒提取总RNA和制备cDNA，并进行实时荧光定量PCR检测。葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)引物，F：5’-TTGCTGACCTGAGGAACGC-3’，R：5’-GTCTCCGACCACTGCCACC-3’；葡萄糖转运蛋白2(GLUT2)引物，F：5’-GCCCTCTTGATGGGATGTTC-3’，R：5’-CTGAGTGTGGTTGGAGC-GAT-3’；GAPDH引物，F：5’-TCCGTGTTCCTACCCCCAA-3’，R：5’-GCCCTCAGATGCCTGCTTC-3’(从NCBI中下载基因序列，使用Primer 5设计引物)；单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)引物(张敏芳等，2010)，F：5’-GCCCCACTCACCTGCTGCTACT-3’，R：5’-CCTGCTGCTGGTGATCCTCTTGT-3’。引物均由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。反应条件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，39个(G-6-Pase和GLUT2)或40个(MCP-1)循环。以GAPDH作为内参基因，使用2-△△Ct法计算。

1.6 统计学数据分析

数据采用SPSS 23.0进行单因素方差分析，多组间两两比较使用LSD法，以平均数±标准差表示各项数据，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 美洲大蠊精粉对高脂饮食小鼠体质量增长率的影响

低、中、高剂量组小鼠的日摄食量分别为6.13 g±0.26 g、5.97 g±0.42 g和5.94 g±0.43 g，与对照组(6.18 g±0.48 g)之间的差异无统计学意义(P>0.05)。

第7、14和21天各组小鼠体质量增长差异无统计学意义(P>0.05)，第28、35、42和49天实验组小鼠体质量增长率均低于对照组，其中，第42和49天中、高剂量组小鼠体质量增长率显著或极显著低于对照组(P<0.05，P<0.01)(图1)。

2.2 美洲大蠊精粉对高脂饮食小鼠血糖含量的影响

第42天实验组小鼠血糖含量均低于对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)。第49天与对照组相比，低、高剂量组的血糖明显下降(P<0.05)(图2)。

图1 小鼠体质量增长率Fig. 1 Body mass growth rate of mice

与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01； 下同

Compared with control group，*P<0.05，**P<0.01； the same below

图2 小鼠血糖含量的变化Fig. 2 Content change of blood glucose in mice

2.3 美洲大蠊精粉对高脂饮食小鼠血清肌酐含量的影响

第42天和第49天实验组小鼠血清肌酐含量均低于对照组，其中，第49天低、高剂量组的血清肌酐含量明显低于对照组(P<0.05)(图3)。

2.4 美洲大蠊精粉对高脂饮食小鼠肝脏G-6-Pase和GLUT2 mRNA表达水平的影响

第42天实验组小鼠肝脏G-6-Pase mRNA表达水平均低于对照组，其中，中、高剂量组与对照组的差异有高度统计学意义(P<0.01)；GLUT2 mRNA表达水平与对照组的差异无统计学意义(P>0.05)。

图3 小鼠血清肌酐含量的变化Fig. 3 Content change of serum creatinine in mice

第49天低、中、高剂量组小鼠肝脏G-6-Pase mRNA(P<0.05，P<0.05，P<0.01)和GLUT2 mRNA(P<0.01)表达水平均显著低于对照组(图4)。

2.5 美洲大蠊精粉对高脂饮食小鼠肾脏MCP-1 mRNA表达水平的影响

第42天实验组小鼠肾脏MCP-1 mRNA表达水平与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。第49天低、中、高剂量组肾脏MCP-1 mRNA表达水平均显著或极显著低于对照组(P<0.05，P<0.05，P<0.01)(图5)。

图4 美洲大蠊精粉对小鼠肝脏G-6-Pase和GLUT2 mRNA表达的影响Fig. 4 Effects of Periplaneta americana powder on the relative expression of G-6-Pase and GLUT2 mRNA in the liver of mice

图5 美洲大蠊精粉对小鼠肾脏MCP-1 mRNA表达的影响Fig. 5 Effect of Periplaneta americana powder on the relative expression of MCP-1 mRNA in the kidney of mice

3 讨论

血脂水平升高常常引起肥胖症。本研究中实验组小鼠的体质量增长率从第3周之后均低于对照组，表明美洲大蠊精粉能有效改善高脂饮食所造成的小鼠肥胖现象。

高血脂症是糖尿病的并发症之一，其发生率随着血糖的升高而增大，糖尿病患者患心血管疾病的危险性也提高(连建谦，2011)，而长期高脂膳食也能引起血糖升高(田明杰等，2013；Whiteetal.，2016)，所以高血脂症与高血糖之间的关系密不可分。糖异生主要发生在肝脏中，G-6-Pase作为糖异生的限速酶之一，可催化葡萄糖-6-磷酸转化为葡萄糖，其活性的降低可抑制糖异生进程从而降低血糖浓度(张思聪等，2017)。GLUT2主要分布在肝脏、肾脏、小肠和胰腺中，可对肝脏葡萄糖进行双向调节。有研究表明，高糖可增加肝细胞中GLUT2 mRNA表达水平，以及高浓度胰岛素会降低其浓度(Burcelinetal.，1992；Posticetal.，1993)。Kiho等(1999)发现,冬虫夏草多糖成分的降血糖活性可能是通过提高糖尿病小鼠肝脏中的葡萄糖激酶活性和减少GLUT2蛋白的含量实现的。何玉兰等(2017)认为，肝源性糖尿病患者的糖代谢异常可能与其肝脏组织中GLUT2表达增加有关。本研究首次探究并初步发现，灌胃给予美洲大蠊精粉的实验组小鼠与对照组比，血糖和肝脏中G-6-Pase mRNA表达水平下降，GLUT2 mRNA表达水平在第42天无明显变化但第49天明显减少，暗示美洲大蠊精粉下调高脂饮食小鼠的血糖含量可能与其抑制肝脏中G-6-Pase mRNA的表达和调节GLUT2 mRNA表达水平有关。

脂代谢紊乱可造成肾脏损伤(Zhangetal.，2016)。梁秀慈等(2013)用高脂乳剂灌胃小鼠，发现高脂乳剂组小鼠的肾脏病理切片中肾小球和肾小管受到损伤。肌酐是肾功能主要指标之一，当肾脏损伤时，肌酐水平明显上升。MCP-1是参与糖尿病肾炎发生的关键细胞因子之一，可促进其他炎性因子的释放和各种炎性细胞在肾小球聚集，引起肾脏损伤(Lim & Tesch，2012；朱章志，2017)。美洲大蠊及其提取物的肾脏保护作用及相关作用机制尚无研究，本实验初步探究发现，实验组的小鼠血清肌酐含量和肾脏中MCP-1 mRNA表达水平低于对照组，表明美洲大蠊精粉可能通过抑制高脂饮食小鼠肾脏中MCP-1 mRNA表达水平来减轻肾脏损伤，对肾脏有一定的保护作用。

综上所述，美洲大蠊精粉能改善高脂饮食小鼠的体质量、血糖和血清肌酐水平。本研究推测，美洲大蠊精粉降血糖机制可能与其降低肝脏中G-6-Pase mRNA表达和调节GLUT2 mRNA表达水平有关；美洲大蠊精粉可能通过下调肾脏中MCP-1 mRNA表达水平从而降低高脂饮食小鼠肾脏炎症反应，减轻肾脏损伤。