米诺环素多克隆抗体的制备

米诺环素又称二甲胺四环素、美满霉素、美诺星、康尼Minocycline、Minomycin、Klinomycin等，是一种高效、速效、长效的新半合成四环素类抗生素，其抗菌作用为该属中最强，抗菌谱与多西环素相似，作用较四环素强2～4倍，也胜过多西环素、美他环素、土霉素。目前国内外有关米诺环素的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)薄层色谱法(TLC)以及毛细管电泳法(CE)，这些方法虽然检测结果准确、灵敏度高,但是待测样品前处理过程复杂、费时。免疫学方法基于抗原、抗体之间的特异反应,具有快速、灵敏、特异性强、操作简单等特点，是残留检测的有效方法,不仅适用于大量样品的快速筛选,某些情况下也可以用于确证性检测。

米诺环素为小分子化合物，本身不具有免疫原性，运用免疫学方法进行检测首先应将其与大分子蛋白质载体进行偶联，产生所需的免疫原性。本文应用戊二醛法和重氮化法将米诺环素在适当的条件下与牛血清白蛋白(BSA)进行偶联,合成了MNC完全抗原MNC-BSA，免疫动物后制成多克隆抗体，旨在为米诺环素残留免疫学快速检测方法的建立奠定基础。

材料与方法

材料

米诺环素由中国药品生物制品检定所提供；新西兰大白兔由沈阳市盛京医院提供。

试剂与仪器

弗氏完全佐剂(CFA)、弗氏不完全佐剂(IFA) sigma公司；牛血清白蛋白(BSA) 北京奥博星生物技术有限公司；戊二醛(GA)、考马斯亮兰G250、甲醇钠-甲醇溶液均为分析纯。

Model 68酶标仪 Bio—Rad公司；TU-1810紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；RET BASIC磁力搅拌器 德国IKA公司；LZG-02冷冻干燥机 康源保鲜技术发展公司；DNP—9162型恒温箱 上海精宏实验设备有限公司 。

米诺环素人工抗原的合成

戊二醛法合成法：称取7.5mg MNC和34mg BSA分别溶于1ml超纯水和10ml PBS（0.1mol/L pH=7.4的磷酸缓冲液），将MNC溶液在搅拌下加入BSA溶液，缓慢滴入0.2ml 25% 戊二醛，搅拌4h,5000r/min离心10min，上清液于磷酸缓冲液（0.01 mol/L pH=7.4）中4℃下透析5d，每天换两次透析液，透析完毕后冷冻干燥，分装，-20℃冻存，备用。

重氮化法合成法：称取7.5mg溶解在5ml超纯水中，加入8ml溴水碱液，4℃下预冷。避光向上述反应液中缓慢滴加1mol/L的盐酸调pH值至2.5，4℃避光逐滴滴加1ml预冷的亚硝酸钠贮备液到上述反应液，冰箱孵育1h，将重氮化的MNC按20：1比例慢慢加入BSA溶液，冰箱孵育24h，随后于4℃下透析5d，每天换两次透析液，透析完毕后冷冻干燥，分装，-20℃冻存，备用。

人工抗原的鉴定与结合比的测定

用磷酸缓冲液PBS配制适宜浓度的BSA与MNC标准液，适当稀释后以PBS为空白，在波长200-500nm下对他们进行紫外扫描，绘制紫外吸收光谱曲线。按合成米诺环素完全抗原和包被抗原反应所用半抗原、载体蛋白与偶联产物的比例，用紫外分光光度计扫描测定，按(1)式计算偶联物的结合比。

式中：Ca／Cb—偶联物中A、B两种物质摩尔浓度比(结合比)；ACam、ACbm—偶联物分别在A、B最大吸收波长下的吸光值；KAam、KBbm—A、B在各自最大吸收波长下的摩尔消光系数；KAbm—A在B最大吸收峰波长处的摩尔消光系数；KBam—B在A最大吸收峰波长处的摩尔消光系数。

抗体的制备与纯化

选用2只体重2kg左右的雄性新西兰大白兔分别为1、2号兔进行免疫,共5次,免疫前采血作为阴性血清。首次免疫：将2mg/ml完全抗原与等量弗氏完全佐剂(CFA)充分乳化后进行皮下10点注射。加强免疫：每隔14d加强免疫一次,剂量不变,CFA换成弗氏不完全佐剂(IFA)。每次加强免疫一周后，耳缘静脉采血，检测效价。当效价达到一定水平，停止免疫7d后心脏穿刺采血，分离抗血清，并采用辛酸一硫酸铵二步沉淀法纯化抗体，制成冻干粉，于-20℃下保存备用。

抗体免疫活性的测定

抗体效价的测定

抗血清效价测定参照文献，利用间接ELISA法测定免疫获得的抗体效价。

工作浓度

采用方阵实验法测定包被抗原和酶标抗体稀释度，确定直接竞争ELISA法抗原和酶标抗体最适工作浓度。OD490值约为1.0，抗体-抗原用的浓度组合即为抗体-抗原的工作浓度。

抗体的特异性考察

参照上述间接ELISA法和方阵滴定法确定抗原抗体的最适工作浓度，在最佳工作条件下，用间接竞争ELISA法检测MNC抗血清与氯霉素、链霉素、红霉素、金霉素、土霉素、多西环素等其它抗菌素的交叉反应率。间接竞争ELISA法操作步骤与间接ELISA基本一致，不同的是封闭反应完成后加入的不是倍比稀释的待测血清，而是将梯度稀释的药品溶液与固定浓度的抗血清混合，分别加入板孔中．以空白对照0 ng／mL MNC时的吸光值为B0，不同质量浓度MNC竞争后的吸光值为B，以B／B0为纵坐标，质量浓度(ng／mL)的对数为横坐标，绘制标准MNC的抑制曲线，同时根据下列公式计算交叉反应率。

结果与分析

人工抗原的鉴定

半抗原MNC分别在波长222、252、273和348nm处有典型吸收峰。由图1可以看出,戊二醛合成法合成的MNC-BSA的最大吸收峰由原来在278nm处呈最大吸收峰的BSA逐渐向252nm处偏移，直至波长266nm处。BSA的最大吸收波长为278nm，在300-400nm几乎无吸收，而结合物的紫外光谱在300nm长波方向有明显的吸收值，并且相同浓度的结合物和标准蛋白的紫外光谱相比较，吸光度明显增加，光谱明显具有MNC和蛋白叠加的特性。重氮化法合成的完全抗原也有相同的特性。以上结论表明两种偶联方法中米诺环素（MNC）和牛血清白蛋白（BSA）载体已经发生偶联。

图1 戊二醛法和重氮化法合成的两种完全抗原的紫外扫描光谱图

人工抗原结合比的测定：

经计算戊二醛法与重氮化法半抗原与BSA的结合比分别人为9.9和5.9。两种方法的偶联比差异明显，其中，戊二醛法的效果明显好于重氮化法。所以采用戊二醛合成法合成的复合物为抗原进行动物免疫实验。

多克隆抗体效价及工作浓度

用间接ELISA测定经免疫获得的抗血清的效价为16000。经方阵实验法测定包被抗原和抗体的稀释度，确定直接竞争ELISA法中抗原和抗体的最适工作浓度分别为抗原2ug/ml、酶标抗体4ug/ml。

表1 米诺环素与其他抗生素的交叉反应率

多克隆抗体的特异性考察

多克隆抗体的特异性鉴定：

在最佳的包被抗原与抗体浓度下，加抗体的同时加入米诺环素或其他结构类似化合物（土霉素、金霉素、多西环素、青霉素等），检测米诺环素及类似物对获得的米诺环素多克隆抗体的交叉反应情况。由表1可知，实验获得的抗体除与土霉素和多西环素和金霉素有交叉反应外，与其他化合物未见交叉，交叉反应率均小于0.1%。

米诺环素标准曲线的绘制

在优化的条件下对不同浓度的米诺环素标准液进行测定，以米诺环素质量浓度的对数值为横坐标，抑制率为纵坐标作图，即得其标准曲线（如图2）

从标准曲线可以判定，在7.8～500ng/ml的浓度范围内，米诺环素质量浓度的对数和抑制率成线性相关。其线性方程为Y=28.839x-12.97 R2=0.9874

图2 米诺环素标准曲线

根据回归方程计算，IC50=152.6ng/ml 其最低检出限IC10=6.3ng/ml

结果与讨论

目前,我国进出口食品中四环素类的残留检测采用的是高效液相色谱法,这种方法对被测样品的前处理要求高,检测的灵敏度不够高,而免疫学检测方法具有快速、灵敏等优点。在免疫学检测中，抗原和抗体的制备是整个分析方法中最为关键的技术。本实验分别采用戊二醛法和重氮化法，将载体蛋白与半抗原MNC进行偶联，得到了完全抗原MNC-BSA，采用戊二醛法合成的抗原偶联比达到10，而且用本法合成的完全抗原免疫兔，抗血清效价达到1:16000。

交叉实验表明，米诺环素除对四环素类抗生素交叉反应较高外，对其他类似药物均表现出较低的交叉反应性（＜0.1），因此可应用于四环素类多残留检测。本文测定的最低检测限为6.3ng·ml-1，远低于动物性食品中米诺环素残留标准，可满足米诺环素残留快速检测的需要，并为后期单克隆抗体的制备和胶体金免疫层析法检测奠定了基础。