PCR-芯片杂交法CYP2C9和VKORC1基因多态性检测系统的性能验证

刘志云，范军秀，姚利飞，彭卫，王伟，邓茂林

(上海市东方医院吉安医院检验科，吉安 343000)

近年来，质量控制越来越受到医学实验室的重视，根据医学实验室能力认可（ISO15189）和美国病理协会（CAP）的要求，任何一个用于常规检测的新系统或新项目在使用前必须进行性能验证[1，2]。随着分子生物学和精准医学广泛用于临床，药物基因检测是本科室开展的重要检测项目，其检测系统的性能验证是保证其检测质量的重要环节，根据 《CNAS-CL36医学实验室质量和能力认可准则在分子诊断领域的应用说明》[3]使用PCR-芯片杂交法对上海百傲生物科技有限公司生产的人类CYP2C9&VKORC1基因多态性检测试剂盒准确性、特异性、最低检测限和抗干扰能力进行验证，验证结果如下：

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取上海市东方医院吉安医院2017年12月-2018年6月临床拟用华法林但未使用任何溶栓药物治疗的53例患者，其中男33例，女 20 例，平均年龄（63.5±5.3）岁，临床诊断明确。所有就诊者无家族病遗传史，无血缘关系。

1.2 主要试剂和仪器 全自动核酸提取仪 （湖南圣湘生物科技有限公司）；人类CYP2C9&VKORC1基因多态性检测试剂盒（PCR-芯片杂交法，上海百傲生物科技有限公司）。抗干扰物物质胆红素(上海源叶生物有限公司；批号：20120322)；抗干扰物物质胆固醇(上海将来实业有限限公司；批号：136036）；抗干扰物物质甘油三酯 (上海将来实业有限限公司；批号：118624）。罗氏Cobas z 480 PCR扩增仪，Baio全自动杂交仪 （上海百傲生物科技有限公司），Baio BE-3.0生物芯片识读仪 （上海百傲生物科技有限公司）。

1.3 DNA的提取和扩增 采集所有研究对象静脉血 2ml（EDTA-K2 抗凝，4℃保存），用全自动核酸提取仪提取外周血DNA及纯化，置-20℃保存备用。按照上海百傲生物科技有限公司生产的人类CYP2C9&VKORC1基因检测试剂盒的要求对代谢基因CYP2C9(*2C430T、*3A1075C)及受体基因VKORC1(G1639A)进行检测，同时使用试剂盒自带的质控品做阴阳性对照。使用罗氏Cobas z 480扩增仪进行扩增，使用百傲基因芯片杂交仪进行芯片杂交，使用百傲BE-3.0芯片识读仪及其相应软件对杂交好的芯片进行识读并对数据进行分析。

2 结果

2.1 准确性 随机选取20例拟用华法林药物的患者临床样本，按照人类CYP2C9&VKORC1基因多态性检测试剂说明书的要求进行PCR-芯片杂交检测，判断其人类CYP2C9&VKORC1基因型，并将提取好的核酸样本送至华大基因生物公司行双向测序，两方法学间结果比对符合率≥90%即正确度验证通过。本实验20例临床标本使用PCR-芯片杂交法和双向测序比对结果符合率为100%，即本实验正确度验证通过。见表1。

表1 PCR-芯片杂交法和双向测序法准确性结果标比对表

表2 PCR-芯片杂交法和双向测序法特异性结果标比对表

2.2 特异性 按照人类CYP2C9&VKORC1基因检测试剂盒说明书要求，分别选取10例CYP2C9-430、CYP2C9-1075及VKORC1-1639野生型的基因（准确度验证时通过双向测序确定）共30例进行PCR-芯片杂交，检测其基因位点，并送至华大基因生物公司进行双向测序，每个野生型基因在两方法学间的比对结果符合率≥90%即特异度验证通过。30例标本使用PCR-芯片杂交法检测的3个野生型基因结果及其测序结果均为野生型，两方法学结果比对符合率为100%，本实验特异度验证通过。见表2。

2.3 最低检出限 选取1例核酸浓度为25ng/μl、其基因型为CYP2C9*1/*2(*2CT/*3AA)&VKORC1-1639AA的临床基因组DNA，用BE洗脱液倍比稀释为 12.5ng/μl、6.25ng/μl、3.125ng/μl、1.563ng/μl及 0.78ng/μl。 选 择 3.125ng/μl、1.563ng/μl 及 0.78ng/μl 3个浓度使用PCR-芯片法重复各检测20次，按照各浓度标本的检测结果与稀释前结果比对的符合率≥85%为有效浓度，该最低有浓度为该检测体系的检测下限。选择的3个浓度中3.125ng/μl、1.563ng/μl两浓度的检测结果与稀释前的基因型一致，符合率为100%，而浓度为0.78ng/μl标本的检查结果与稀释前的符合率只有30%，故该浓度应该剔除。故本实验的检测下限为1.563ng/μl。

2.4 抗干扰能力 取3例已知基因型的临床标本，基因型分别为 CYP2C9*1/*1(*2CC/*3AA)&VKORC1-1639AA，CYP2C9*1/*3(*2CC/*3AC)&VKORC1-1639AA，CYP2C9*1/*2(*2CT/*3AA)&VKORC1-1639AA。每例标本分为10份，每份200μl，其中1份不添加任何干扰物，设为对照组，其余9份平均分为3组，每组分别加入甘油三酯、总胆固醇、总胆红素，配制成浓度分别为47mmol/L、65mmol/L和34.2mmol/L的待检标本。实验组与对照组检测结果之间的符合率≥90%即抗该物质干扰验证通过。按照血液基因组DNA提取的方法提取上述样本血液基因组DNA，然后用CYP2C9和VKORC1基因多态性检测试剂盒按照说明书方法测定上述3个基因型，每个样本检测2次，结果表明加入甘油三酯、总胆固醇和总胆红素标本的基因型与对照组完全符合，符合率为100%，本实验抗干扰验证通过。

3 讨论

CYP2C9是细胞色素P450酶（CYP）第二亚家族中的重要成员，占肝微粒体P450蛋白总量的20%。CYP2C9参与抗凝血药、抗惊厥药、降糖药、非甾体类解热镇痛抗炎药、抗高血压药以及利尿药等多种药物的羟化代谢，其中华法林、甲苯磺丁脲和苯妥因那均为治疗指数较窄的药物[4-8]。CYP2C9活性变化可导致这些药物体内浓度出现较大变化，甚至导致严重药物不良反应的发生。华法林是临床上常用的抗凝药物，是深静脉血栓、心房纤颤、心脏瓣膜置换术和肺栓塞等疾病的一线用药，其临床疗效和不良反应存在很大的个体差异，血药浓度过高或敏感性增加可导致严重出血事件[9-11]。心脑血管疾病已成为严重危害我国国民健康、特别是中老年人的一种常见病，具有高患病率、高致残率，高死亡率的特点，其发病率位居我国首位。相关资料表明，目前，我国有超过2.9亿心血管疾病的患者，每年因心血管疾病死亡的人数达300万[12]，因此，对心血管疾病患者进行合理用药，延长患者的生存质量，越来越受到临床重视。

近年来的，越来越多的药物基因检测技术用于临床用药指导。根据美国《临床实验室改进法修正案》和实验室认可的要求，实验室在开展常规检测项目之前，必需对重现其试剂说明书提供性能指标[13]。本研究参照《CNAS-CL36医学实验室质量和能力认可准则在分子诊断领域的应用说明》和江西省临床基因扩增实验室质量管理的相关规定，参考试剂说明书，结合实验的实际情况对准确度、特异性、最低检出限和抗干扰能力分析性能进行验证。

准确性是指试验中真阳性结果判断为阳性的比例。本试验通过PCR-芯片杂交法检测20例临床样本，同时将提取好的核酸送至华大基因生物公司进行双向测序，将两者结果进行实验间的比对，本研究检测的结果与华大基因的测序结果完全符合，表明准确性符合厂商宣称的要求，验证通过。

特异性是指试验中真阴性结果判断为阴性的比例。对于基因突变检测定性项目，将PCR-芯片杂交法检测的野生型基因组DNA进行测序，如测序结果也为野生型则判为真阴性。本次试验中将10例CYP2C9&VKORC1野生型基因位点进行测序，结果均为野生型，与PCR-芯片杂交法检测的结果一致，证明了本试剂盒的特异性良好，本次实验因标本量不多，在今后的工作中随着检测标本量的增多，可完善对特异性性能的评估。

最低检出限是指检测系统和检测试剂的确定被分析物的最低浓度或量，是定性检测项目的一个重要的分析性能。本次性能验证中，将提取纯化好的基因组DNA稀释倍比稀释至1.56ng/μl，对稀释最低阳性检测标本重复检测20次的结果与未稀释前的结果完全一致，证明本次性能验证的最低检出限能比试剂厂家声明的最低检出限更低。

抗干扰能力是指检测结果不受标本中黄疸、脂血和溶血现象影响的能力。本次研究中，分为3组，分别加入甘油三油、胆固醇、总胆红素，配制成浓度分别为47mmol/L甘油三酯、65mmol/L胆固醇和34.2mmol/L总胆红素的待检标本，这三个均为试剂说明书表明的最高浓度，每组检测3次，进行验证，验证结果与对照结果完全符合，表明试剂的抗干扰能力良好。在实际检测过程中，标本的还可能存在其它的干扰物质如嗜异性抗体的干扰，有条件的实验室可进行更多的抗干扰能力的验证。

综上所述，对一个新的检测系统或项目进行性能验证，是保证检测质量的基础。本研究参照ISO15189和 CL36文件的相关要求对CYP2C9&VKORC1基因检测试剂盒说明书进行相关性能指标验证，其目的在保证项目验收的基础上，保证检测结果的准确性，从而为临床提供可靠的检测结果，更好的为患者服务。