核酸疫苗pEGFPN1-MLAA34-B7H4IgV的构建及其免疫活性观察

赵臣，王婉莹，赵佳琪，刘爽，王丽，张梦凡

(吉林医药学院检验学院，吉林吉林132013)

急性白血病(AL)是一种常见的、致死性的血液系统恶性肿瘤，病死率高，极易复发。微小残留白血病(MRD)是指急性白血病经诱导化疗完全缓解或干细胞移植后，患者体内仍然残留有少量白血病细胞的状态，MRD是急性白血病复发的根源。核酸疫苗是将外源基因导入动物体细胞内，并通过宿主细胞表达抗原蛋白，诱导宿主产生免疫应答反应，以达到预防和治疗疾病的目的[1]。研究发现，核酸疫苗能同时诱导细胞免疫和体液免疫，激发白血病患者特异性免疫应答，清除化疗后残余肿瘤细胞，是有望克服MRD的方法之一[2]。2015年1月～2017年12月，我们选择急性白血病相关抗原基因MLAA34以及负性共刺激分子B7H4作为构建核酸疫苗靶基因，优化抗原表位基因，构建核酸疫苗pEGFPN1-MLAA34-B7H4IgV，并对其免疫活性进行观察，旨在为白血病的免疫防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料 E.coli DH5α菌株、pEGFPN1质粒、pEGFPN1-MLAA34质粒、pEGFPN1-B7H4IgV质粒、单核巨噬细胞THP-1为本课题组保存；噻唑蓝(MTT)试剂、限制性内切酶(EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ)、无内毒素质粒提取试剂盒购自NEB公司；总RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒、T4 DNA连接酶和胶回收纯化等试剂盒及胎牛血清(FBS)、DMEM(低糖)培养基购于生工生物工程(上海)股份有限公司；广谱蛋白Maker购自Hyclone公司；ELISA试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；BALB/c小鼠(SPF级，雌性，6～8周龄)购自北京维通利华实验技术动物有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 核酸疫苗pEGFPN1-MLAA34-B7H4IgV的构建

1.2.1.1 引物设计 根据MLAA34基因(GenBank:AY288977.2)和B7H4IgV基因(GenBank: NM_001190366.1)序列分别设计MLAA34基因引物P1/P2和B7H4IgV基因引物P3/P4，见表1。其中MLAA34基因长度为1 014 bp，B7H4IgV基因长度为849 bp。P2和P3引物末端分别加入重叠序列GGGGGCGGAGGCTCCGGCGGCGGGGGGTCTGGGG-

GCGGGGGAAGC，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 MLAA34和B7H4IgV基因引物序列

注：P1和P4引物下划线为酶切位点；P2和P3引物下划线为互补重叠序列。

1.2.1.2 pEGFPN1-MLAA34-B7H4IgV重组质粒的构建与鉴定 采用重叠延伸(SOE)-PCR法。分别以pEGFPN1-MLAA34质粒和pEGFPN1-B7H4IgV质粒为模板，以P1/P2和P3/P4引物扩增MLAA-34基因和B7H4IgV基因；再以P1和P4为引物，SOE-PCR法扩增MLAA34-B7H4IgV融合基因；最后将pEGFPN1质粒和融合基因MLAA34-B7H4IgV分别用限制性内切酶EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ进行双酶切，酶切产物用T4 DNA连接酶进行连接，将连接产物转化感受态菌E．coli DH5α。挑取阳性克隆，提取质粒，分别用PCR法、酶切法鉴定。

1.2.2 核酸疫苗pEGFPN1-MLAA34-B7H4IgV免疫活性观察

1.2.2.1 动物分组与免疫 BALB/c鼠28只，随机分为4组各7只。按试剂盒说明书大量制备和纯化质粒DNA，并用生理盐水调整至1.0 mg/L；P、M、B、MB组分别在小鼠两侧股四头肌内侧肌内注射磷酸盐缓冲液pEGFPN1、pEGFPN1-MLAA34、pEGFPN1-B7H4IgV、pEGFPN1-MLAA34-B7H4IgV质粒，每只100 μg。接种前24 h，用0.25%布比卡因100 μL预处理。在0、2、4周，各行1次同剂量加强免疫；分别于0、4、8周眼球取血1.5 mL/只(肝素抗凝)，取血后立即处死无菌摘取脾脏。

1.2.2.2 血清抗体及细胞因子水平检测 取1.2.2.1中的肝素抗凝血约1.0 mL，离心提取血浆；ELISA法检测免疫8周血清中抗体IgG1、IgG2a，以及免疫0、4、8周血清细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ，按试剂盒说明书操作。

1.2.2.3 THP-1细胞增殖抑制作用观察 将脾脏置于不含FBS的RPMI1640培养基中，剪去脂肪及筋膜组织；于200目不锈钢网筛上研碎，重悬于含5% FBS的Hank′s液中；以2 000 r/min离心5 min，低渗裂解红细胞；用含10% FBS的RPMI1640培养基清洗3次，调整细胞密度为1×107/mL。脾淋巴细胞悬液倍比稀释后，取100 μL加入到培养的THP-1细胞中，使效靶比分别为50∶1、25∶1、12.5∶1、6.25∶1，各设3个复孔；在37 ℃、5% CO2中孵育24 h进行反应，同时设不同浓度效应细胞对照孔及靶细胞对照孔。MTT法检测THP-1细胞增殖情况，计算细胞增殖抑制率，以此表示小鼠脾淋巴细胞的杀伤活性。细胞增殖抑制率=1-(对照组OD-实验组OD)/(对照组OD-空白组OD)×100%。

2 结果

2.1 核酸疫苗pEGFPN1-MLAA34-B7H4IgV构建结果 MLAA34-B7H4IgV融合基因PCR产物电泳检测约为2 000 bp，与理论值(1 922 bp)相符；pEGFPN1-MLAA34-B7H4IgV酶切后电泳检测为5 000～7 500 bp，与理论值(6 655 bp)相符。

2.2 各组血清细胞因子水平比较 与同组免疫0周时、同时点P组比较，免疫4、8周时M、B、MB组血清细胞因子IL-2、IL-4水平升高而IFN-γ水平降低(P均<0.05或<0.01)。与同时点M、B组比较，MB组血清细胞因子IL-2、IL-4水平升高而IFN-γ水平降低(P均<0.05)；M、B组同时点比较，差异无统计学意义。见表2。

表2 各组血清IL-2、IL-4、IFN-γ水平比较

注：与同时点P组比较，aP<0.05，bP<0.01；与M组比较，cP<0.05；与B组比较，dP<0.05；与同组免疫第0周比较，eP<0.05。

2.3 各组血清抗体水平比较 见表3。

表3 各组血清IgG1、IgG2a水平比较

注：与P组比较，aP<0.05；与M组比较，cP<0.05；与B组比较，dP<0.05。

2.4 各组THP-1细胞增殖抑制率比较 见表4。

3 讨论

1990年，美国学者Wolff等发现将纯化的DNA或RNA表达质粒直接肌内注射给小鼠，可使局部肌细胞内表达该基因，并且这种表达持续时间长，可达数月甚至终生，这一重大发现被称为疫苗研究史上第3次革命[3，4]。核酸疫苗制作简单、应用安全、免疫效果好，可刺激机体同时产生细胞免疫和体液免疫，可用于MRD的免疫治疗[5]。

表4 小鼠脾淋巴细胞杀伤活性

注：与同效靶比P组比较，aP<0.05，bP<0.01；与M组比较，cP<0.05；与B组比较，dP<0.05。

导入机体内的目的基因是核酸疫苗发挥免疫保护作用的关键。本研究选择急性白血病相关抗原基因MLAA-34和负性共刺激分子B7-H4来构建目的基因。MLAA-34基因与急性单核细胞白血病的发生密切相关，其表达下调能抑制白血病细胞在体外增殖，诱发白血病细胞的凋亡，与急性白血病的不良预后密切相关[6～8]；B7-H4可以抑制T细胞的激活、增殖，抑制细胞因子释放和T细胞毒作用，参与了肿瘤的免疫逃逸[9]。研究发现，B7-H4的IgV样区与MHC分子轻链可变区作用相似，B7-H4主要通过其IgV样区与受体相结合，从而抑制T细胞的增殖、细胞因子的释放和细胞毒作用[10]，对T细胞的免疫应答发挥抑制性调节作用[11]，是理想的肿瘤免疫治疗的靶基因。

本研究采用SOE-PCR技术将两个目的基因MLAA-34和B7-H4IgV融合在一起，形成MLAA34-B7H4IgV融合基因，两个基因之间采用柔性肽基因GGGGGCGGAGGCTCCGGCGGCGGGGGGTCTGGGGGCGGGGGAAGC作为重叠序列，保证了两个蛋白融合表达且正确折叠，MLAA-34和B7-H4IgV皆能发挥其独特功能，相比于限制性内切酶的酶切更加简便快捷[12]。将此融合基因作为核酸疫苗的目的基因，利用B7-H4IgV将MLAA-34表达到免疫细胞表面，产生相应的抗体和细胞因子，拉近免疫细胞与靶细胞的距离；之后anti-B7H4IgV与靶细胞表面B7-H4受体结合，阻断了肿瘤细胞的免疫逃逸，提高T细胞的应答反应，激活T细胞释放因子和发挥细胞毒性作用[9]，使核酸疫苗充分发挥其免疫保护作用。

本研究表明，免疫BALB/c小鼠后，MB组THP-1细胞增殖抑制率高于同效靶比其他各组。这表明小鼠脾淋巴细胞在核酸疫苗pEGFPN1-MLAA34-B7H4IgV的作用下，被致敏活化，对相应的白血病细胞产生了较强的增殖抑制作用；同时BALB/c小鼠经核酸疫苗免疫后，MB组血清IL-2和IFN-γ水平增高。这说明在核酸疫苗pEGFPN1-MLAA34-B7H4IgV的作用下，其细胞免疫被激活，产生了较强的特异性细胞免疫，参与了系统机体免疫应答。此外，BALB/c小鼠经核酸疫苗免疫后，MB组血清IgG1水平高于其他各组，而细胞因子IL-4水平降低。这说明该核酸疫苗pEGFPN1-MLAA34-B7H4IgV能诱发强烈的体液免疫，增强了机体对肿瘤细胞的免疫应答，具有明显的免疫保护作用。

总之，本研究以优势表位基因构建了核酸疫苗pEGFPN1-MLAA34-B7H4IgV，并对其抗原性和免疫原性进行检测，发现核酸疫苗能激活动物体内细胞免疫和体液免疫，对白血病细胞具有杀伤作用，具有明显的抗白血病效应，为白血病的免疫治疗研究奠定了基础。