尖孢镰孢菌胁迫下番茄病程相关基因表达研究

杜宾，畅引东，董海龙，何瑞，李新凤，徐玉梅，王建明*

(1.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801；2.太原学院 园艺系，山西 太原 030012)

番茄是全世界栽培最为普遍的果菜之一,也是我国各个蔬菜产区主要种植的蔬菜种类。近年来，随着我国生鲜番茄及其制品消费的高速增长和番茄种植面积的不断增加，连作重茬问题变的日益突出，番茄土传病害亦日趋严重，其中番茄枯萎病(Tomato Fusarium wilt)已成为影响番茄生产可持续发展的一个重要的限制因素。由于其病原菌在番茄整个生长期均可侵染，而且其初侵染来源也比较广，加之其防治比较困难，所以给番茄的生产造成了严重的影响[1,2]。目前，选育和种植抗病品种是解决该病害最有效的方法之一，明确番茄的抗病机理则是培育抗病品种的基本前提。在寄主与病原的互作过程中，植物抗病相关基因的产物直接参加了抵抗病原物侵染的活动，它们的表达调控遵循了一定的规律。通过对植物抗病相关基因表达规律进行研究，有利于了解相关基因的功能，为有效的防治此类病害提供理论基础，进而利用成熟的基因工程技术。

病原可诱导寄主细胞内一系列编码蛋白质的基因表达，这些蛋白中有许多在植物防卫和应激反应中起重要作用，被称为病程相关蛋白(Pathogenesis-related protein, PR)[3]。研究还发现各种诱抗剂的使用，可使番茄植株细胞组织、多种酶类和PR蛋白的活性及含量等产生明显变化，从而增强番茄植株的抗病性[4]。例如，香蕉植株经1.5 mmol·L-1外源甲基茉莉酮酸酯处理后，激活香蕉植株的抗病防御体系，其体内的几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶和总酚类物质的含量升高，其体内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、多氧化物酶(PPO)、氧化氢酶(CAT)及苯丙氨酸氨裂合酶(PAL)等酶的活性升高[5]。葡聚糖酶作为植物超敏反应中合成的一类重要水解酶，其编码基因Glu过量表达才足以降解侵入的病原真菌，最终使得植株免于受害[4]。研究还表明，水杨酸、乙烯/茉莉酸和脱落酸信号传导途径参与了植物对病原菌的抗性反应[5]。Wang等人以拟南芥为模式寄主进行研究，发现转录因子ATAF1可以调节对病原镰孢菌的抗性反应[6]。通过比较枯萎病胁迫下番茄抗感品种的生理响应，发现在病原菌胁迫下抗感病品种中各种酶都会有响应，且抗病品种中酶活性明显高于感病品种[7]。当甜瓜感染尖孢镰孢菌甜瓜专化型1号生理小种后，抗性品种根部的氧化物酶(POX)、多氧化物酶活性(PPO)及酚类化合物(PCs)含量显著升高，说明这些酶在品种抗性诱导中起到重要的作用[8]。酶活性的增强，涉及到相关基因的上调表达，受其编码基因调控。

多年来，研究人员采用分子标记技术、表达序列标签、抑制差减杂交技术、基因芯片、基因组学等多种生物学方法对寄主与病原互作条件下植物中差异表达基因及其功能进行了大量的研究[9]，筛选出大量编码病程相关蛋白基因，有些病程相关蛋白编码基因在植物受侵染胁迫条件下的作用机制还有待进一步的研究。本研究拟采用实时荧光定量PCR手段对病原菌侵染番茄过程中番茄PRP5(Pathogenesis-related protein 5)、PRP10(Pathogenesis-related protein 10)、ERTF1B(Ethylene-responsive transcription factor 1B-like)、DRRP206(Disease resistance response protein 206-like)和PO(Polyphenol oxidase)等基因的实时表达情况进行分析研究，以进一步明确番茄病程相关基因在侵染胁迫条件下的表达调控机理。

1 材料与方法

本试验于2016年5月-2017年8月在山西农业大学农学院植物病理学重点学科实验室和作物遗传育种重点学科实验室进行。

1.1 供试寄主

番茄栽培品种中蔬四号(购自太谷农资市场)：将番茄种子浸入含2%有效氯的次氯酸钠消毒液，放入摇床中室温下振荡消毒30 min，转速设为150 r·min-1，用灭菌水冲洗3次。转移至新的灭菌水中55 ℃条件下温汤浸种15 min，转移至28 ℃灭菌水中浸种7 h。然后将种子均匀播种于装有灭菌沙土的育苗盘，放置于光照培养箱中，温度设定为28 ℃。待育苗盘中番茄出苗超过80%后，将光照培养箱光照和黑暗时间段调节为14 h∶10 h；光照条件下温度设定为25 ℃，黑暗条件下温度设定为20 ℃；湿度光照条件下设为80%，黑暗条件下设为60%；注意控制培养基质湿度，适时浇水，以防徒长。

1.2 供试菌种

供试菌种为尖孢镰孢菌番茄专化型菌株，由山西农业大学农学院植物病理学实验室提供。菌株培养和孢子收集：将活化的菌株接种于绿豆汤培养液，在恒温摇床中培养4 d，温度和转速设置为25 ℃和150 r·min-1。4 d后离心收集孢子，使用血球计数板测定孢子浓度，用灭菌水将孢子浓度调节到1×106mL-1，保存于4 ℃条件下备用。

1.3 接种及取样方法

待番茄幼苗长至3叶期时，将幼苗从育苗盘挖出，浸入无菌水中漂洗根部，随后将其置于1×106mL-1的孢子悬浮液中，浸根1 h，以无菌水处理做空白对照，每个处理共30株幼苗，设3次重复。接种后的幼苗，转移到装有无菌水的三角瓶中，置于恒温光照培养箱中，设置生长条件为28 ℃，湿度80 %，光暗比为14∶10(定期摇瓶，以增加液体中含氧量)。

参照前人对尖孢镰孢菌对寄主植物早期侵染过程的研究，本试验设计在接种后3 h、6 h、12 h、24 h、48 h和7 d 取样，选取植株根茎部位，样品可立即进行RNA提取或立即用液氮冷冻，保存在-80 ℃超低温冰箱备用。本试验共设置3个生物学重复。

1.4 DNA和RNA的提取与反转录合成单链cDNA

番茄幼苗根部DNA和总RNA，分别依照DNAsio Plus(9770, Takara)和RNAsio Plus(9108，Takara)的步骤进行提取，提取的DNA和总RNA分别经琼脂糖凝胶电泳进行质量检测后，使用Eppendorf紫外分光光度计测定其浓度。将其一部分稀释到工作浓度后，储存于4 ℃冰箱中备用，其余样本储存于-80 ℃冰箱。

RNA反转录，选用反转录酶PrimeScriptTMRT reagent Kit(RR047, Takara)，依照其步骤将样本RNA反转录为单链cDNA，反转录前使用反转录试剂盒提供的试剂去除RNA中残余的基因组DNA。反转录后的单链cDNA经Eppendorf紫外分光光度计测定浓度，并稀释为工作浓度，储存于-20 ℃冰箱备用。

1.5 基因表达的实时荧光定量PCR分析

本试验中选取的番茄病程相关蛋白编码基因编号详见表1。从NCBI网站获得基因序列，在番茄的表达序列标签数据库进行比对，依据比对结果选取相似性较高区域基因序列在IDT网站(Integrated DNA Technologies)设计实时荧光定量PCR引物，设计的引物经过Premier Primer 6.0软件进行序列结果分析，并在NCBI网站使用Primer-blast程序以尖孢镰孢菌和番茄基因组数据为对照进行引物特异性的检测。设计的引物由上海生工生物有限公司合成，得到引物后分别以尖孢镰孢菌和番茄的基因组DNA为模板进行PCR扩增，以验证引物的特异性。选取特异性好的引物进行下一步试验，本试验中所选用的引物信息详见表2。

为理清病原菌入侵后寄主植物抗病的分子机制，以不同处理条件下罹病植株的单链cDNA为模板，以番茄ACTIN基因作为内参，选用SYBR Premix Ex Taq II试剂盒(RR820，Takara)分别对供试的基因进行实时荧光定量PCR，以测定病原与寄主互作条件下目的基因的表达情况。PCR反应采用两步法，其条件为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性5 s，62 ℃退火15 s，共40个循环，每次循环的最后一步收集SYBR Green荧光，在循环结束时从65 ℃开始绘制溶解曲线直到95 ℃，每次增加0.5 ℃，每次反应时间5 s。每个反应体系设置3个技术重复，共设3次生物学重复。

1.6 数据统计分析

试验数据分析根据目的基因和各个内参基因的阈值循环(Ct)，用2-ΔΔCT计算相对表达量；在Excel 2010和SPSS22.0软件上分别运用T-测验法、单因素方差分析和事后Tukey多重比较检验处理间的差异显著性。

目的基因相对表达量的增减比率按照以下公式进行计算：

(处理组目的基因相对表达量-对照组目的基因相对表达量)/ 对照组目的基因相对表达量=目的基因相对表达量增减比率

2 结果与分析

2.1 病原菌胁迫下番茄幼苗生长

水培条件下，对照组和处理组中番茄幼苗在接种后3 h、6 h、12 h、24 h、48 h 和7 d时的生长情况如图1所示。从图1可看出，接种尖孢镰孢菌番茄专化型菌株的处理组番茄幼苗植株在接种后48 h内未表现出萎蔫症状，在接种7 d时即可表现出明显的萎蔫症状；而对照组中未接种的番茄幼苗在3 h、6 h、12 h、24 h、48 h和7 d 均未表现出萎蔫症状。

2.2 病原菌胁迫下番茄病程相关基因相对表达量分析

番茄植株的病程相关基因在接种尖孢镰孢菌番茄专化型菌株后不同时期的动态表达结果见表2。从表2可知，PRP10基因在接种病原菌的番茄幼苗植株中表达受到抑制，其相对表达量在接种后6 h下降至0.51，在12 h～7 d这段时间基因相对表达量基本维持在0.72～0.81之间，而对照组中该基因表达量在6 h时升至2.13，在12 h 时升至5.62，随后缓慢下降至1.84，处理组和对照组之间基因相对表达量差异极显著。PRP5基因在接种病原菌的番茄幼苗植株中表达呈上调状态，在侵染48 h时该基因表达量为0.73，而对照组的相对表达量高达1.42，在接种7 d时该基因的相对表达量显著上升，达到1.74，远高于对照组。ERTF1B基因在接种病原菌的番茄幼苗植株和对照组中的相对表达量很低，除24 h、48 h和7 d之外，其相对表达量值基本一致，无显著差异。DRRP206和PO两基因在接种病原菌的番茄幼苗植株中的表达在3～12 h时呈上调状态，在这段时间内两基因的相对表达量持续上升，在12 h时的相对表达量分别为3.08和2.53,而对照组中两基因的相对表达量值则整体低于处理组。此后两基因在侵染后7 d的相对表达量分别下降至1.01和0.74，但其相对表达量值整体高于对照组。

表1 实时荧光定量PCR引物信息Table 1 Information of the primers used for real-time quantitative PCR

表2 番茄病程相关基因的相对表达量值Table 2 Relative expression values of pathogenesis-related genes of SL

注：CK为对照组未接种番茄植株，CH65为处理组接种的番茄植株；采用T-测验方法比较对照组与处理组中同一基因的相对表达量差异，结果由*表示P<0.05，**表示P<0.01；采用单因素方差分析和事后Tukey’s多重比较对同一组内相同基因不同处理阶段的相对表达量进行显著性分析，不同大写字母表示P<0.01，相同字母表示P>0.05。

Note: CK denotes the non-inoculated plant, CH65 denotes the inoculated plant, the treatment group；The relative expression value differences between each pair of samples (the expression of the same gene in CK and treatment) were tested using the t-test and indicated by *P<0.05 and**P<0.01; Within the same group, the relative expression value differences of the same gene at different periods were tested using the One-Way ANOVA and post hoc Tukey’s multiple comparisons, the different capital letters denoteP<0.01, the same letter denotesP>0.05.

图1 番茄幼苗接种病原菌后不同时期生长情况Fig.1 Growth condition of tomato seedling at different periods after inoculation of F. oxysporum f. sp. lycopersici 注：3 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h 和 7 days 表示番茄幼苗采集时期; CK为2株空白对照，Treatment为接种尖孢镰孢菌番茄专化型的处理组。Note: 3 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, and 7 days denote tomato seedlings collection periods; CK denotes two seedlings inoculated with sterilized water, treatment denotes two seedlings inoculated with F. oxysporum f. sp. lycopersici.

2.3 病原菌胁迫下番茄病程相关基因相对表达变化趋势分析

番茄病程相关基因在接种尖孢镰孢菌番茄专化型菌株后不同时期处理组和对照组中的相对表达量增减比率见图2。从图2中可知，在接种后6 h时仅有PRP5和DRRP206基因在处理组和对照组中的相对表达量增减比率有明显的增长，其中PRP5基因在此后的相对表达量增减比率呈下降趋势，于12 h时降至-0.27，随后其相对表达量增减比率于接种后7 d达到最高值为3.82；而DRRP206基因的相对表达量增减比率继续增长，于12 h时达到最高值达3.15；在此时，PO基因的相对表达量增加比率达到其最高值达3.39，此后DRRP206和PO两基因的相对表达量增减比率持续下降，于24 h达最低值，之后又呈缓慢上升趋势，在接种7 d时的相对表达量增减比分别为2.46和1.82；PRP10和ERTF1B基因在接种病原菌后其相对表达量增减率处于负值水平，相对表达量呈下降趋势，ERTF1B基因在接种后24 h时相对表达量增减比率达最低值，随后上升呈正值水平，并于48 h形成一个峰值，而PRP10基因在接种后其相对表达量增减比率一直为负值，呈缓慢下降趋势，在接种后12 h后相对表达量比值逐渐回升。结合表2，可看出本试验中涉及的病程相关基因在处理组和对照组中的增减比率与其相对表达量值基本呈正相关。

图2 番茄受侵染时病程相关基因的相对表达量增减比率Fig.2 Increase and decrease rate of relative expression for tomato pathogenesis-related genes

3 讨论

本试验中番茄幼苗植株在接种尖孢镰孢菌番茄专化型菌株48 h内未表现出任何症状，在接种7 d后即可观察到显著的萎蔫症状。尖孢镰孢侵入寄主植物2 d后，病原菌即可侵入维管束，同时出现大量的侵填物堵塞导管[11,12]。在侵入7 d后，菌丝可抵达木质部导管[13]，被侵入的皮层区(cortical area)细胞质和细胞壁大多数被分解[14]，菌丝体的大量产生使导管堵塞妨碍了水分运输，从而引起植株萎蔫[15]。本试验中番茄幼苗在接种48 h虽未能在表型上观察到明显的病状，但是在处理组和对照组番茄病程相关基因表达研究中发现在接种病原菌48 h内，部分病程相关基因的相对表达量值有较大差异，推测其在病原与寄主的互作中参与了抵抗病原菌侵染的活动。

本试验选取的番茄病程相关基因中，NM_001288651编码番茄病程相关蛋白10，多数的病程相关蛋白可通过SA、JA、ABA或ET等信号复合物诱导，从而拥有抵抗微生物活性，研究发现经尖孢镰孢菌诱导可引起病程相关蛋白10编码基因的转录表达[16]。该编码基因的同源STH-2-like基因与番茄对大丽轮枝菌的抗性密切相关[17]。Deepti等人的研究发现该类基因的表达可以清除由代谢和脂质过氧化产生的醛类细胞毒性[18]。本试验中，该基因在病菌入侵初期该基因相对表达量值显著低于对照组，无法正常表达，可能是由于病菌与植株间处于信号识别阶段，病原菌中某些物质抑制其表达。在菌株识别成功开始侵入后，植株中该基因表达仍然较低，可能该基因的表达与侵染病原种类有较大的相关性，土豆中该类基因表达表现出较强的小种特异性[19]，亦可能与番茄品种抗病性相关。XM_004238172编码番茄病程相关蛋白5，在多种植物中该基因家族可由病原菌诱导表达，在欧李抗病品种中该类蛋白能够在真菌入侵时激活其抗性反应并增强欧李抗病性[20]，而本试验中该基因在侵染初期对于病原菌的入侵响应不强，在入侵7 d后才有响应，表明供试番茄品种中该基因在病原菌侵染初期未能及时参与到寄主对病原菌的抗性反应。XM_004234188编码番茄乙烯应答转录因子1B，转录因子在植株的内生免疫体系中扮演着重要角色，而乙烯应答转录因子是激素路径的集成器(integrator)，负责许多JA/ET响应抗性基因的转录调控[21]，在本试验中该基因在处理组和对照组中的表达量都很低，表明供试番茄品种中该基因未参与到番茄的抗病反应。XM_004245506编码番茄抗病响应基因206，番茄植株受侵染时该基因会有持续、大量的表达[22]，本试验中XM_004245506基因在应对菌株入侵时的表达量显著增多，随后降低，表明该基因与寄主植物的抗性相关，参与了寄主对病原的抗性反应。AW154864.1编码多酚氧化酶，该酶是植物的防御相关蛋白，在植株遭受逆境、创伤和侵染时形成，表现出多家族性，在番茄中有7个编码多酚氧化酶的基因[23]。诸多的研究表明植物中多酚氧化酶水平与其对病原菌的抗性呈正相关[24]，在本研究中病原菌诱导后番茄中该基因的表达显著高于对照组，且番茄病株根部会出现褐化，表明番茄植株中该基因参与了对病原侵入的响应，也有研究表明该基因的表达是植物中一种正常的代谢反应[25]，因此该类基因是否参与寄主对病原的抗性反应还有待进一步的研究。

4 结论

综上所述，番茄品种中蔬四号在接种尖孢镰孢菌番茄专化型菌株后第七天即表现出明显的萎蔫症状，属感病品种。本试验选取的番茄病程相关基因在病原菌胁迫条件下的表达量各异，其中PRP10、PRP5和ERTF1B基因在尖孢镰孢菌胁迫侵染条件下表达量较低，可能是其在参与抗性反应过程中受到了病原菌致病因子的抑制；而DRRP206和PO基因在尖孢镰孢菌胁迫侵染条件下表达量较高，但整个植株在接菌7 d后表现出的仍然是感病的状态，没有显示出很强的抗性，表明这些基因在病原菌侵染过程中被诱导表达，但不足以使植物抗病。