介绍颜色反应中的几种试剂

重庆市凤鸣山中学(400037)

冯汉茹

1 教学背景

组成细胞的有机物主要包括糖类、蛋白质、核酸和脂质等，某些化学试剂能和这些有机物产生相应的颜色反应，借助人的感官对颜色反应的直接观察或对比观察，以此检测和验证生物组织中某种物质的存在。但开展物质鉴定类实验有2个弱点：①学生不能一一对应鉴定试剂和被检测物质的关系，无法客观地评价实验结果；②学生因不清楚试剂配置过程以致混淆操作步骤，无法准确地描述分析实验的现象。基于此，本文选取斐林试剂、班氏试剂、双缩脲试剂、二苯胺试剂、吡罗红甲基绿混合染色剂和龙胆紫溶液展开介绍，对比学习试剂配置过程和使用方法，有利于物质鉴定类实验的顺利开展和推进。

2 斐林试剂与班氏试剂

糖的化学本质是多羟基醛或多羟基酮以及它们的衍生物或多聚物。鉴定可溶性还原糖(如葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、乳糖和碱性溶液中的果糖等)常用斐林试剂或班氏试剂。

斐林试剂由质量浓度0.1 g/mL的氢氧化钠溶液(甲液)和质量浓度0.05 g/mL的硫酸铜溶液(乙液)配制而成，二者混合后立即生成了新鲜的淡蓝色氢氧化铜沉淀。其中，0.1 g/mL的氢氧化钠溶液是由10 g氢氧化钠，加蒸馏水至100 mL，待充分溶解后倒入试剂瓶中配置而成。0.05 g/mL的硫酸铜溶液是由5 g硫酸铜，加蒸馏水至100 mL，待充分溶解后倒入试剂瓶中配置而成。反应原理为：Cu2+具有弱氧化性，还原糖的醛基(-CHO)具有还原性可在水浴加热条件下被氧化为酸，Cu(OH)2被还原为砖红色Cu2O沉淀，颜色变化为淡蓝色——棕色——砖红色。反应式为：R-CHO+2Cu(OH)2→R-COOH+Cu2O↓+2H2O。醛被氧化形成了酸，而酮不能被斐林试剂氧化，所以斐林试剂除了鉴定还原糖之外，还可以区别醛和酮。

配制斐林试剂需要将甲液、乙液等量混合均匀后形成Cu(OH)2悬浊液。若先加入甲液，组织中的有机酸与NaOH迅速反应，反应物中Cu(OH)2没有或不足，继而还原糖的半缩醛羟基易被氧化而失去还原性，再加入硫酸铜溶液不能产生Cu2O沉淀，只有将二者先混合配置后，才能产生Cu(OH)2，所以斐林试剂要现用现配。若斐林试剂久置过后，在使用前摇匀也不能用，因为现用现配的“有效成分”是新制的处于悬浮透明胶体状态Cu(OH)2，放置过久，Cu(OH)2会完全沉淀，反应很慢甚至没有反应。

班氏试剂也称本尼迪特试剂，Cu2+在OH-存在的条件下氧化还原糖中的醛基，自身则被还原成砖红色Cu2O沉淀。其有两种配制方法：①由硫酸铜、无水碳酸钠和柠檬酸钠配成的弱碱性蓝色溶液，存放备用；②由硫酸铜、碳酸钠和枸橼酸钠配成的弱碱性蓝色溶液，主要成分是Cu2+和枸橼酸根离子形成的物质，存放备用。

3 双缩脲试剂

蛋白质是由氨基酸组成的一类生物大分子，是生命的物质基础。鉴定蛋白质或多肽常用双缩脲试剂。双缩脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)与双缩脲试剂并不相同。将尿素加热到熔点以上，2分子尿素之间失去1分子氨生成了双缩脲，即NH2-CO-NH2+NH2-CO-NH2→NH2-CO-NH-CO-NH2+NH3↑。双缩脲含有化学里的酰胺键，生物中也称肽键(-CO-NH-)，能与碱性溶液中的Cu2+结合生成紫色络合物，从而发生双缩脲反应。

蛋白质或多肽的肽键和双缩脲的肽键相同，凡含有两个及两个以上肽键的蛋白质或多肽能与双缩脲试剂发生紫色反应，检测生物组织中是否含有蛋白质。即便蛋白质在加热条件下变性，空间结构发生改变，但肽键并没有破坏，只要含有两个及两个以上肽键，双缩脲试剂依然能和变性的蛋白质发生紫色反应。但双缩脲试剂不能与二肽或尿素发生紫色反应，而是出现蓝色络合物沉淀。

双缩脲试剂由质量浓度0.1 g/mL的氢氧化钠溶液(双缩脲试剂A)和质量浓度0.01 g/mL的硫酸铜溶液(双缩脲试剂B)配制而成。

鉴定蛋白质操作过程有两种：①先向试管内加入一定量的待测组织样液，再加入适量的双缩脲试剂A液，混合均匀后再滴入几滴双缩脲试剂B液以制得碱性条件下中的Cu2+，观察试管中颜色变化；②先向试管内加入适量的双缩脲试剂A液，再滴入几滴双缩脲试剂B液，混合均匀后，再加入一定量待测组织样液，观察试管中颜色变化。待测组织样液和双缩脲试剂加入的顺序可以改变，但双缩脲试剂A液、双缩脲试剂B液是先后加入的，不可颠倒以造成碱性环境。若先加入双缩脲试剂B液，后加入双缩脲试剂A液，重金属盐CuSO4让蛋白质变性溶解度变小的同时，CuSO4与NaOH发生复分解反应无法制造碱性环境还生成了蓝色氢氧化铜Cu(OH)2沉淀，导致现象模糊，无法达到实验目的。

4 吡罗红甲基绿混合染色剂与二苯胺试剂

吡罗红甲基绿混合染色剂呈碱性，含有“两”种染料，常用来观察DNA、RNA在胞内的分布，需要现用现配。

混合使用的原因如下。

(1)甲基绿呈蓝绿色，吡罗红(也称派洛宁或焦宁)呈红色，在没有结合核酸的情况下也是“本色”。

(2)若分别用甲基绿、吡罗红染料染两组细胞，甲基绿既结合DNA又结合RNA，均为蓝绿色，无法区别DNA、RNA的分布；吡罗红既结合DNA又结合RNA，均为红色，也无法区别DNA、RNA的分布。

简言之，仅用甲基绿，无法鉴定DNA亦无法鉴定RNA。两种染料混合使用，它们对DNA、RNA亲和力不同，甲基绿更亲合聚合程度高的DNA呈现绿色，吡罗红更亲合聚合程度低的RNA呈现红色，从而可以区别二者的主要分布。

鉴定DNA常用二苯胺[(C6H5)2-NH]试剂，而不使用甲基绿。二苯胺试剂与DNA混匀，在沸水浴条件下呈蓝色。它有两种配制方法。

(1)取0.8 g二苯胺溶于180 mL冰醋酸中，再加入8 mL 60%以上的过氯酸，混匀待用，临用前加入0.8 mL 1.6%的乙醛溶液，配置成无色溶液。

(2)取1.5 g二苯胺溶于100 mL冰醋酸，再加入1.5 mL浓硫酸，棕色瓶保存，制得A液；随后配置体积分数0.2%的乙醛溶液为B液，再取0.1 mL B液加入A液，制成二苯胺试剂。

DNA在沸水浴条件下与二苯胺试剂反应显示蓝色。反应原理为：DNA中嘌呤核苷酸的脱氧核糖与酸生成ω-羟基-γ酮基戊醛，ω-羟基-γ酮基戊醛与(C6H5)2-NH反应显示蓝色，即DNA+CH3COOH+C6H5-NH-C6H5→蓝色物质。所以，鉴定DNA用二苯胺试剂，而区分DNA、RNA的分布用吡罗红甲基绿混合染色剂。

5 龙胆紫溶液、醋酸洋红染液、改良苯酚品红溶液

染色体由DNA、组蛋白、非组蛋白和少量RNA组成，易被碱性染料染成深色的物质，具体来说，用龙胆紫溶液、醋酸洋红染液、改良苯酚品红溶液来鉴定染色体，它们分别将染色体染成紫色、紫红色、紫红色。龙胆紫，碱性染料，主要是结晶紫和甲基紫的混合物。配制方法：取30 mL冰醋酸加热至40 ℃，放入0.75 g龙胆紫，溶解后加入70 mL蒸馏水，过滤后备用。醋酸洋红染液配制方法：取100 mL45%的醋酸溶液，加入0.5～1 g洋红，煮沸5 min或加回流煮沸12 h，冷却后进行过滤，再加入1%～2%铁明矾水溶液数滴，直到该液体变为暗红色不发生沉淀为止，最后将液体放入棕色瓶中贮存避免阳光直射。改良苯酚品红(也称改良碱性品红)溶液由碱性品红混合液与苯酚混合而成，配制方法：母液A，取3 g碱性品红溶解在100 mL70%的酒精；母液B，取10 mL母液A，加入90 mL5%的苯酚水溶液；苯酚品红溶液，取45 mL母液B，加入6 mL冰醋酸和6 mL 37%的甲醛；改良苯酚品红溶液，取2～10 mL苯酚品红溶液再加入98～90 mL45%的冰醋酸和1.8 g山梨醇。

6 总结

综上所述，用颜色反应鉴别生物组织中的物质时应仔细了解试剂配置过程和使用方法，灵活分辨被检测物质和鉴定试剂的化学反应原理，在本学科知识正确指导的前提下，再培养学生进行实验的操作能力、观察能力、分析能力。