广西西瓜、甜瓜细菌性果斑病菌检测及药剂毒力测定

谢慧婷，李战彪，谭海文，秦碧霞，崔丽贤，蔡健和*

(1. 广西农业科学院植物保护研究所，广西 南宁 530007；2.广西作物病虫害生物学重点实验室，广西 南宁 530007；3.广西桂林市蔬菜研究所，广西 桂林 541004)

【研究意义】瓜类细菌性果斑病(Bacrerial Fruit of Blotch，BFB)是一种检疫性植物病害，对瓜类作物具有毁灭性。目前在全国西瓜甜瓜主产区均有发生，其病原菌为西瓜嗜酸菌(Acidororaxcitrulli)[1]，可侵染西瓜、甜瓜等多种葫芦科作物。病菌主要通过种子进行传播，在种子中的存活时间可长达19年，抗干旱和衰老能力强[2-3]，病菌在含病残体的土壤中可存活12个月，在不含病残体的土壤中可存活8个月[4]。当条件适宜时，潜在的病菌可导致病害的大面积爆发，给西瓜甜瓜种植业造成严重的经济损失。广西常年种植西瓜甜瓜面积约10万hm2[5]，该病害从20世纪90年代中期开始在广西发生为害，导致许多育苗场损失惨重[6]。因此，开展有关细菌性果斑病菌抑制药剂的研究，建立细菌性果斑病菌的PCR检测技术，对于预防病害通过带病种子种苗传播扩散，从而控制广西疫情的蔓延具有重大意义。【前人研究进展】关于瓜类细菌性果斑病病害的药剂防治研究报道较多，但是各地防治效果有所不同。赵廷昌等[7]发现种子消毒以3 %盐酸处理效果最好，其次为47 %加瑞农可湿性粉剂和新植霉素。王中武等[8]发现47 %加瑞农可湿性粉剂和90 %新植霉素可溶粉剂在苗期发病时用药效果最好。黄金艳等[9]利用春雷霉素对嫁接前西瓜接穗材料进行处理降低了发病率。王雪等[10]的研究表明，西瓜菌株和甜瓜菌株对同一药剂的敏感性差异较大。陈海燕等[11]对海南甜瓜细菌性果斑病进行田间药效试验，结果表明20 %二氯异氰尿酸钠可湿性粉剂防效最好。张路生等[12]的研究表明88 %水合霉素、33.5 %喹啉酮和72 %农用链霉素对山东省瓜类细菌性果斑病菌的抑制效果较好。贾云鹤等[13]对黑龙江省西瓜细菌性果斑病进行防治药剂的筛选，研究发现双氧水、硫酸链霉素、噻霉酮、福尔马林、氢氧化铜、春雷霉素和新植霉素对病菌具有较好的抑制作用。王爽等[14]的研究发现噻霉酮、农用链霉素、中生菌素和春雷霉素对海南西瓜细菌性果斑病菌的抑菌效果较好。【本研究切入点】虽然国内关于西瓜类细菌性果斑病的药剂防治的研究较多，但各地研究结果差异较大，对广西该病害防治工作的参考作用有限。【拟解决的关键问题】有针对性地选取实际生产中常用的13种细菌性药剂，采用抑菌圈法对广西瓜类细菌性果斑病菌进行室内毒力测定，筛选出具有较好防效的药剂，为广西开展该病害的药剂防治工作提供指导。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试样品来源：2014-2017年间广西各地植保植检部门、种苗公司、育苗户等送检的葫芦、西瓜、南瓜、甜瓜等葫芦科种子种苗样品以及本研究采集到的疑似病样。

DNA提取及PCR扩增：参考植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提供的方法进行细菌DNA提取，检测所选引物参考邱晓静[15]BX-SL1:5′-CAGCTGGGAGCGATCTTCAT-3′/SR2: 5′- GCGTCAGGAGGGTGAGTAGCA-3′，273 bp，引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。PCR反应体系(10.0 μl)：2×TaqMasterMix 5.0 μl，引物BX-SL1 (10 μmol/L)和SR2 (10 μmol/L)各0.5 μl，菌体DNA模板0.5 μl，双蒸水3.5 μl。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃30 s，58 ℃30 s和72 ℃45 s，共进行30个循环；72 ℃10 min，4 ℃下保存。PCR产物用1 %的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

供试药剂：1号杀菌剂(中国农业科学院植物保护研究所赵廷昌教授赠送)、40 %甲醛(成都市科龙化工试剂厂)、硫酸链霉素(南京奥多福尼生物科技有限公司)、72 %农用硫酸链霉素可溶粉剂(华北制药股份有限公司)、80 %乙蒜素乳油(河南科邦化工有限公司)、12 %中生菌素母药(福建凯立生物制品有限公司)、64 %杀毒矾可湿性粉剂(先正达作物保护有限公司)、47 %加瑞农可湿性粉剂(日本北兴化学工业株式会社)、30 %琥胶肥酸铜可湿性粉剂(齐齐哈尔四友化工有限公司)、20 %吗胍·乙酸铜可湿性粉剂(齐齐哈尔四友化工有限公司)、46 %氢氧化铜水分散粒剂(美国杜邦公司)、20 %噻菌铜悬浮剂(浙江龙湾化工有限公司)和2 %春雷霉素水剂(日本北兴化学工业株式会社)。

供试病原菌：菌株WM0922-3分离自厚皮甜瓜叶片，菌株XD0611-7分离自薄皮甜瓜果实，菌株XD0819-2分离自西瓜品种(籽瓜)果实，3个供试菌株均已完成科赫氏法则，结合16S rDNA序列分析，证明供试菌株均为西瓜嗜酸菌(Acidororaxcitrulli)[16]。供试菌株在YDC培养基中保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 BFB检出率统计方法 对种子种苗及样品进行BFB检测，统计分析检出率。

1.2.2 药剂浓度配制 参考各药剂推荐使用剂量，每个药剂选择5个梯度浓度，按照浓度由高到低的顺序依次使用无菌水稀释，各浓度药剂现配现用。

1.2.3 带菌培养基制备采用抑菌圈打孔法[17]将KB培养基与各菌悬液浓度约为1(108cfu/mL)按10∶1的体积比分别混匀，每皿20 mL，制成带菌平板，用直径5 mm的灭菌打孔器在每皿打5个孔，将40 μl药剂分别加入已编号孔中，每浓度3个重复，于28 ℃恒温箱中培养，48 h后采用十字交叉法测量抑菌圈直径。

1.2.4 统计方法 根据公式计算菌落生长抑菌率(%)=[(处理抑菌圈直径-对照抑菌圈直径)/处理抑菌圈直径]×100；采用DPS v7.05版软件进行毒力回归方程数据分析，以药剂浓度对数值为自变量，抑菌率的几率值为因变量，建立毒力回归方程，并求出各药剂的EC50及相关系数R2，比较不同药剂的抑菌率[18]。

2 结果与分析

2.1 BFB检测情况

2014-2017年送检的葫芦种子包括韩砧一号、安生、金砧一号、本地葫芦和来自山东、甘肃等地的散装葫芦种，南瓜种子包括雪砧金刚、壮士、吉冠373等，西瓜种子包括农优新一号、珠农大美人、甜王三号等，甜瓜种子包括蜜语香瓜、丁型香瓜等。送检的葫芦种子、南瓜种子、西瓜种子及种苗、果实均检出BFB(表1)。4年合计送检种子345份，其中葫芦种子203份，检出率为6.4 %；南瓜种子31份，检出率为9.68 %；西瓜种子66份，检出率为4.55 %；甜瓜种子45份，检出率为26.67 %；送检西瓜嫁接苗65份，检出率为7.69 %。

期间课题组从广西南宁、桂林、贺州、北海、百色等市采集西瓜、甜瓜样品共计405份(表2)，其中西瓜样品187份，检出率为10.69 %；厚皮甜瓜样品186份，检出率为6.99 %；薄皮甜瓜样品32份，检出率为18.75 %。从南宁、北海、贺州市采集的样品中BFB检出率较高，从百色市采集的样品中未检出BFB，部分样品的PCR检测结果见图1。

2.2 13种杀菌剂对3个菌株抑菌率比较

在13种杀菌剂中，其中7种杀菌剂对菌株WM0922-3、XD0611-7 和XD0819-2具有不同的抑制效果(表3)，且每种有效杀菌剂的抑制效果均与药剂浓度呈正比，其中以1号杀菌剂的抑制效果最好，最高浓度药剂对3个菌株的抑菌率均超过83.00 %；其次为40 %甲醛、72 %农用硫酸链霉素可溶粉剂、80 %乙蒜素乳油和64 %杀毒矾可湿性粉剂。其中，硫酸链霉素和12 %中生菌素母药对WM0922-3和XD0611-7具有抑制效果，对XD0819-2却没有抑制作用；72 %农用硫酸链霉素可溶粉剂对XD0819-2的抑制效果明显低于WM0922-3和XD0611-7，且在最低浓度时对XD0819-2没有抑制作用；64 %杀毒矾可湿性粉剂对XD0819-2的抑制效果优于WM0922-3和XD0611-7。

表1 2014-2017年送检种子和种苗检测结果

表2 2014-2017年田间采集疑似病样检测结果

M：MarkerDL2000；CK：清水对照；-：阴性对照；+：阳性对照；1～4：待测样品M;MarkerDL2000;CK:Water control; -:Negative control; +:Positive control; 1-4:Samples图1 细菌性果斑病菌PCR检测结果Fig.1 PCR test result of A. citrulli

余下6种杀菌剂：47 %加瑞农可湿性粉剂(药剂浓度1000～2000 mg·L-1)、30 %琥胶肥酸铜可湿性粉剂(药剂浓度2400～4000 mg·L-1)、20 %吗胍·乙酸铜可湿性粉剂(药剂浓度2500～4500 mg·L-1)、46 %氢氧化铜水分散粒剂(药剂浓度400～800 mg·L-1)、20 %噻菌铜悬浮剂(药剂浓度1000～2000 mg·L-1)和2 %春雷霉素水剂(药剂浓度1500～3100 mg·L-1)均未对菌株表现出抑制作用。

2.3 杀菌剂对3个菌株的毒力回归方程

根据EC50结果发现，在对3个菌株WM0922-3、XD0611-7 和XD0819-2具有抑制作用的杀菌剂中，以1号杀菌剂的EC50最低，分别为0. 2×10-3、0. 1×10-3和0. 4×10-3mg·L-1；其次为40 %甲醛，EC50均小于0.06 mg·L-1；72 %农用硫酸链霉素可溶粉剂对WM0922-3和XD0611-7的抑制作用优于XD0819-2，而80 %乙蒜素乳油和64 %杀毒矾可湿性粉剂对XD0819-2的抑制作用均优于WM0922-3和XD0611-7(表4～6)。

表3 7种杀菌剂对3个果斑病菌株的抑菌率比较

续表3 Continued table 3

药剂名称Name of bactericide药剂浓度Concentration of bactericideWM0922-3XD0611-7XD0819-2平均抑菌圈直径(mm)Diameter of inhibition zone 抑菌率(%)Bacteriostasis平均抑菌圈直径(mm)Diameter of inhibition zone抑菌率(%)Bacteriostasis平均抑菌圈直径(mm)Diameter of inhibition zone抑菌率(%)Bacteriostasis100 mg·L-110.1750.8210.3351.615.000.00150 mg·L-113.3362.5011.8357.755.000.00200 mg·L-114.6765.9113.0061.545.000.00250 mg·L-115.0066.6715.0066.675.000.0072 %农用硫酸链霉素可溶粉剂Streptomycin 72 % SP100 mg·L-111.0054.5510.0050.005.000.00200 mg·L-113.6763.4114.0064.297.5033.33300 mg·L-116.3369.3616.0068.758.3340.00400 mg·L-118.6773.2118.3372.738.8343.40500 mg·L-120.3375.4119.6774.588.8343.4080 %乙蒜素乳油Ethylicin 80 % EC280 mg·L-110.0850.4111.1755.2211.0054.55310 mg·L-110.3351.6111.5056.5211.3355.88340 mg·L-110.3351.6111.8357.7511.0054.55370 mg·L-110.8353.8512.3359.4611.3355.88400 mg·L-111.6757.1412.8361.0411.6757.1412 %中生菌素母药Zhongshengmycin 12 %200 mg·L-15.509.096.3321.055.000250 mg·L-15.8314.296.5323.475.000300 mg·L-16.0016.677.6734.785.000350 mg·L-17.0028.578.0037.505.000400 mg·L-17.1730.238.3340.005.00064 %杀毒矾可湿性粉剂Oxadixyl 64 % WP2500 mg·L-19.5047.375.6711.7615.5067.743000 mg·L-19.8349.1510.6753.1315.1767.033500 mg·L-111.1755.2211.3355.8816.4069.514000 mg·L-111.5056.5211.8357.7516.6770.004500 mg·L-111.6757.1412.6760.5319.0073.68

表4 不同杀菌剂对菌株WM0922-3的毒力回归方程

表5 不同杀菌剂对菌株XD0611-7的毒力回归方程

表6 不同杀菌剂对菌株XD0819-2的毒力回归方程

3 讨 论

本研究结果表明来自西瓜和甜瓜的3个果斑病菌株，各菌株对不同杀菌剂的敏感性有所不同，对同一杀菌剂的敏感性也不同。来自厚皮甜瓜和薄皮甜瓜的菌株WM0922-3和XD0611-7对药剂的敏感性相似，但与来自西瓜品种(籽瓜)的菌株XD0819-2差异相对较大，这与王雪等[10]报道的结果相似。1号杀菌剂和40 %甲醛对3个菌株的防效均较好，这2种药剂生产上主要用于种子处理，在最低浓度为0.1 %时防效分别达到75 %和55 %，这与董春玲等[19]报道的结果相似。72 %农用硫酸链霉素可溶粉剂对3个菌株的抑制效果均较好，对菌株WM0922-3和XD0611-7的抑制效果优于菌株XD0819-2，与王雪等[10]的实验结果相反。酸链霉素对WM0922-3和XD0611-7具有较好的抑制效果，但对XD0819-2却没有抑制作用，这与牛庆伟等[20]报道的结果有所差异，可能与生产厂商、商品纯度，以及实验菌株不同有关。80 %乙蒜素乳油和64 %杀毒矾可湿性粉剂对XD0819-2的抑制效果较好，且优于WM0922-3和XD0611-7，杀毒矾是防治卵菌类真菌病害的常用药剂，本试验发现其对细菌性果斑病菌也有较好效果，这与田英等[21]的研究结果一致。47 %加瑞农可湿性粉剂、30 %琥胶肥酸铜可湿性粉剂、20 %吗胍·乙酸铜可湿性粉剂、46 %氢氧化铜水分散粒剂、20 %噻菌铜悬浮剂、2 %春雷霉素水剂等细菌性病害常用药剂在本实验中均未发现有抑菌作用，这可能与生产上长期大量使用这几种药剂，细菌已产生较强抗药性有关，这与王雪等[10]和万秀琴等[22]报道的结果相似。

Walcott等[23]将64株瓜类细菌性果斑病菌分成两个亚群，亚群1的菌株主要分离自甜瓜、南瓜等，亚群2的菌株主要分离自西瓜，且亚群1的菌株对硫酸铜不敏感。赵文龙等[24]对143株瓜类细菌性果斑病菌进行硫酸铜敏感性检测，结果表明果斑病菌具有稳定的抗铜性，且寄主为甜瓜的菌株比寄主为西瓜的菌株的抗铜性更高。本研究结果也说明了果斑病菌对铜制剂不敏感，因此在生产上需谨慎使用铜制剂防治瓜类细菌性果斑病。

PCR检测发现，广西生产上使用的甜瓜、西瓜种子以及嫁接砧木葫芦种子和南瓜种子均发现携带有细菌性果斑病菌。因此，必须加强对育种、制种基地的检疫监管，加大对有关技术人员和西瓜育苗户的西瓜甜瓜细菌性果斑病防控技术培训力度，并做好种子消毒等处理措施，从源头上切断病害的传播，确保广西葫芦科作物产业的可持续健康发展。本试验选用的铜制剂为生产中使用较为普遍的杀菌剂，结果显示这些铜制剂对该病害均无防治效果，生产上要注意防止菌株产生抗药性，应轮换使用药剂。试验获得的结果仅是室内毒力测定的初步结果，实际田间防治试验正在进一步研究中。

4 结 论

细菌性果斑病菌在广西地区已普遍发生，为了预防病害通过带病种子种苗传播扩散，必须加强对育种、制种的检疫管理。结合本试验结果，在防治广西西瓜、甜瓜细菌性果斑病时建议使用1号杀菌剂和40 %甲醛进行种子消毒处理，在发病初期可以考虑使用杀毒矾等药剂进行防治。