奶牛布鲁氏菌分离与鉴定

吴志仓 ，曹小安 ，林学仕 ，张俊文 ，张丽蓉 ，金淑霞

（1.甘肃省永靖县动物疫病预防控制中心，永靖 7316002；2.中国农业科学院兰州兽医研究所，兰州 730046）

布鲁氏菌病在我国是人的乙类传染病、家畜二类传染病，也是WHO确认的致残率最高的动物源性人畜共患病。畜间布病以牛羊为主，染疫家畜及其产品是人间布病的主要传染源，牲畜养殖、畜产品加工、动物防疫和布病防治工作人员是高发人群。布鲁氏菌病不仅危害人体健康和畜牧业的可持续健康发展，同时还可导致食源性布病感染发生，引发新的食品安全问题，严重影响社会稳定和经济发展。为了查明甘肃省永靖县奶牛感染布鲁氏菌病的菌种和类型，为该地区布病科学防控提供技术支撑，2016年9月，作者等从永靖县某奶牛养殖户中检测出的布病阳性牛中采集病料，进行了病原的分离与鉴定。

1 材料与方法

1.1 病料

3份疑似感染布鲁氏菌病奶牛脾脏。

1.2 病料中基因组的提取

取米粒大小的脾脏放入离心管中，参照文献［1］方法提取总基因组DNA，-20℃冻存备用。

1.3 PCR

用布鲁氏菌Nested-PCR检测病料中的细菌。

1.3.1 反应体系

一扩：10×PCR buffer（含 Mg2+）5 μL，dNTPs 4 μL，BP1 和 BP2 引物各 1 μL，模板 4 μL，无菌双蒸水 35 μL。

二扩：10×PCR buffer（含 Mg2+）5 μL，dNTPs 4 μL，BP3 和 BP4 引物各 1 μL，模板 2 μL，无菌双蒸水 37 μL。

反应时在体系中加入0.25 μLTaqDNA聚合酶。

1.3.2 反应条件

一扩：首先95℃充分变性5 min；94℃变性1 min，49℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，35个循环，最后 72℃延伸10 min。

二扩：94℃变性 30 s，51℃退火 1 min；最后72℃延伸1 min，20个循环，最后72℃延伸6 min。

1.4 细菌的分离

将采集的病料取100 mg左右放置于1.5 mL离心管中，加入500 μL无菌生理盐水用组织破碎仪破碎，5 000 r/min离心10 min，无菌条件下将沉淀均匀涂布在选择性培养基平皿。将涂布好的平板置37℃、5%～10%CO2温箱培养，每天观察细菌生长情况，记录生长菌落数量、颜色、大小、光滑度等，培养15 d无细菌生长者为阴性。以接种针挑取选择性培养平板单菌落，划线接种于固体培养基和液体培养基，置37℃CO2温箱培养，观察纯培养细菌在固体和液体培养基的生长特性。

1.5 分离菌株的AMOS-PCR

1.5.1 引物

AMOS-（A1）：5’-gacgaacggaatttttccaat ccc-3’

AMOS-（M）：5’-aaatcgcgtccttgctggtctga-3’

AMOS-（O）：5’-cgggttctggcaccatcgtcg-3’

AMOS-（S）：5’-gcgcggttttctgaaggttcagg-3’

AMOS-（A2）：5’-gcgcagcgttgcggcaattg-3’

AMOS-（IS711）：5’-tgccgatcacttaagggccttcat-3’

1.5.2 AMOS-PCR体系与条件

EXTaq mix 25 μL，AMOS-（A1）1 μL，AMOS-（M）1.5 μL，AMOS-（O）1.5 μL，AMOS-（S）1 μL，AMOS-（A2）1 μL，AMOS-（IS711）2 μL，DNA 模板 3 μL，ddH2O 14 μL。

条件：95℃5min；94℃1min，60℃1.5min，72℃ 1 min，40个循环，最后72℃作用10 min。

1.6 分离菌株的omp25基因测序

用已知的序列引物扩增分离菌落的DNA，获得omp25基因，克隆到pMD18-T载体上，送测序公司进行测序。将测序结果与已知公开的其他基因组序列用Mega软件进行系统发生树分析。

2 结果

2.1 Nested-PCR结果

通过Nested-PCR对样本检测发现，3份样本均检测出布鲁氏菌感染。

图1 Nested-PCR检测结果

2.2 细菌分离鉴定结果

培养15 d内，3份样本中只有1份样本生长菌落，其余2份样本培养无细菌菌落出现。

2.3 分离菌株AMOS-PCR结果

对分离获得的一株细菌进行AMOS-PCR鉴定，结果扩增出流产布鲁氏菌特征的扩增条带。

图2 分离菌株AMOS-PCR扩增结果

2.4 分离菌株的omp25基因测序与分析

2.4.1omp25基因测序

TCTCGTAATCGTCTCGGCTGCGCTGCTGCCGTTCTCTGCGACCGCTTTTGCTGCCGACGCCATCCAGGAACAGCCTCCGGTTCCGGCTCCGGTTGAAGTAGCTCCCCAGTATAGCTGGGCTGGTGGCTATACCGGTCTTTACCTTGGCTATGGCTGGAACAAGGCCAAGACCAGCACCGTTGGCAGCATCAAGCCTGACGATTGGAAGGCTGGCGCCTTTGCTGGCTGGAACTTCCAGCAGGACCAGATCGTATACGGTGTTGAAGGTGATGCAGGTTATTCCTGGGCCAAGAAGTCCAAGGACGGCCTGGAAGTCAAGCAGGGCTTTGAAGGCTCGCTGCGTGCCCGCGTCGGCTACGACCTGAACC-CGGTTATGCCGTACCTCACGGCTGGTATTGCCGGTTCGCAGATCAAGCTTAACAACGGCTTGGACGACGAAAGCAAGTTCCGCGTGGGTTGGACGGCTGGTGCCGGTCTCGAAGCCAAGCTG

2.4.2 比较分析 系统发生树结果表明（图3），分离获得菌株的omp25基因序列与已经公布的基因序列高度一致。

图3 系统发生树

3 讨论

（1）布鲁氏菌病最近几年在我国再次流行，特别是在西北地区，羊布鲁氏菌流行严重，局部地区出现爆发，在当地布鲁氏菌病在牛羊上也偶有检出病例。2016年，在血清学检测基础上，获得几份疑似布鲁氏菌感染的病料样本，为进一步了解当地牛布鲁氏菌流行菌株及特点，进行细菌的分离与鉴定，结果发现感染牛的布鲁氏菌为流产布鲁氏菌。

（2）虽然用分子生物学方法从3份病料中均扩增出有布鲁氏菌的存在，但细菌的分离只获得了一株布鲁氏菌，分离效率低，而且分离时间长；另一方面，细菌分离效率低的原因可能因流产布鲁氏菌的分离对CO2环境的依耐型等因素引起。