肾康注射液抑制体外培养小鼠腹膜间皮细胞中TNF-α、TGF-β1、VEGF、CTGF的释放

王荔，夏天△，张洪震，李荣

我国成年人群中慢性肾脏病的患病率为10.8%［1］，终末期肾病（ESRD）患者中约有15%选择腹膜透析（PD）替代治疗，且这一比例在逐年增加。由于腹透液的生物不相容性，长期PD容易发生腹膜纤维化（PF）并最终致超滤衰竭，使患者被迫退出治疗［2］。因此，采取有效策略保护腹膜间皮细胞（PMCs）、延缓腹膜纤维化进程、维持有效超滤是保证PD患者长期成功透析的关键。研究发现，许多益气活血、健脾补肾的中药都有抗炎、抗纤维化的作用，可防止或延缓PF［3］。肾康注射液由大黄、黄芪、丹参、红花组方，具有降逆泄浊、益气活血、通腑利湿的功效。本研究通过体外实验探讨肾康注射液对高糖诱导的小鼠PMCs中肿瘤坏死因子（TNF）-α、转化生长因子（TGF）-β1、血管内皮生长因子（VEGF）、结缔组织生长因子（CTGF）等细胞因子的影响及保护PMCs的机制，为其应用于PD相关PF的防治提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 小鼠PMCs（北京蓝梦生物科技股份有限公司）；肾康注射液（国药准字Z20040110，西安世纪盛康药业有限公司）；TNF-α、TGF-β1、VEGF、CTGF的酶联免疫吸附试验（ELISA，武汉博士德生物工程有限公司）及免疫组化试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；磷酸盐缓冲液（PBS）、胰蛋白酶、EDTA、胎牛血清（天津易生源生物科技有限公司），DMEM培养基（Gibco），超纯RNA提取试剂盒、反转录试剂盒及Real-time PCR试剂盒（TaKaRa），相关引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞传代培养 参照文献［4］，将购置的小鼠PMCs弃去原有培养液，以PBS（pH=7.4）冲洗细胞2次；向培养瓶内加入3 mL消化液（0.25%胰蛋白酶+0.016%EDTA）；于37℃培养箱中孵育5～10 min，弃去消化液，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液5 mL终止消化；轻轻吹打至细胞完全自瓶壁脱离；将细胞悬液移入离心管，1 000 r/min离心10 min；弃去上清，加入新鲜培养液（DMEM低糖型+10%胎牛血清+200 U/mL青霉素+200 U/mL链霉素）重悬细胞，取约4×104个细胞接种于新的培养瓶，置于37℃、5%CO2、95%湿度培养箱中静置培养。

1.2.2 PMCs的鉴定 参照文献［4］，采用免疫细胞化学染色的方法，分别进行角蛋白及白细胞CD45抗原染色，光镜下定性观察。

1.2.3 分组及干预 实验分为5组：空白对照组（A组，只加DMEM）；阳性对照组（B组，DMEM+140 mmol/L葡萄糖）；低剂量肾康干预组（C组，在B组的基础上添加体积比1%的肾康注射液）；中剂量肾康干预组（D组，在B组的基础上添加体积比2%的肾康注射液）；高剂量肾康干预组（E组，在B组的基础上添加体积比4%的肾康注射液）。小鼠PMCs经传代培养融合后，消化，传代至第3～4代，分别给予新鲜培养液（按分组情况添加高浓度葡萄糖或不同浓度肾康注射液），培养24 h，倒置显微镜下观察，分别收集细胞和培养上清液，冻存以备检测。

1.2.4 ELISA法检测细胞因子含量 准备待测样品（细胞培养上清液）及标准品加入96孔板，添加生物素标记二抗和酶标试剂，37℃反应60 min，洗板3次，加入显色剂A、B，37℃显色10 min，加入终止液，10 min内酶标仪测光密度（OD450）值，带入标准曲线，计算出样品中TNF-α、TGF-β1、VEGF、CTGF的浓度。

1.2.5 Real-time RT-PCR检测细胞因子的mRNA水平 取冻存于液氮中小鼠PMCs，按试剂盒操作步骤提取总RNA，测定RNA纯度，逆转录反应合成cDNA，再进行PCR扩增，引物序列见表1。PCR反应体系为：2×SYBR Premix Ex Taq12.5µL，上、下游引物（10µmol/L）各0.5µL，cDNA模板2µL，加ddH2O至总体系25µL。扩增条件：95℃30 s；95℃ 5 s，60℃34 s，30个循环。将各样品cDNA稀释10倍后取2µL作模板，分别用目的基因引物和内参基因（Actin）引物进行扩增，每组重复8次，在60～95℃进行熔解曲线分析。采取2-ΔΔCt法进行数据的相对定量分析。

Tab.1 Primer sequences and amplified fragment length表1 引物序列及扩增片段长度

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析；以Levene法进行方差齐性检验，若方差齐，采用LSD-t法，若方差不齐，采用Games-Howell法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠PMCs鉴定结果 细胞传代培养24 h后开始单层贴壁生长，光镜下见细胞呈多边形，生长融合后呈铺路石状排列，具有典型上皮细胞形态，见图1。细胞生长近融合前加入高浓度葡萄糖和不同浓度肾康注射液培养24 h后，倒置显微镜下观察，小鼠PMCs状态良好，生长没有受到明显影响，见图1A、B。细胞免疫组化光镜下观察，所培养的细胞具有PMCs特征，呈角蛋白阳性、白细胞抗原CD45阴性，见图1C、D。

Fig.1 Cultured mouse PMCs in vitro and cellular IHC staining results图1 体外培养的小鼠腹膜间皮细胞及细胞免疫组化

2.2 各组MPMCs培养上清液中细胞因子水平比较 与A组比较，B～E组TNF-α、TGF-β1、VEGF、CTGF均升高（P＜0.05），与B组比较，除C组VEGF和 CTGF外，各实验组 TNF-α、TGF-β1、VEGF及CTGF表达水平均显著降低（P＜0.05），且随着肾康浓度的升高，上述细胞因子的表达水平呈下降的趋势，见表2。

Tab.2 Four kinds of cytokines levels in the culture supernatant fluid of five groups表2 5组小鼠PMCs培养上清液中4种细胞因子的水平（n=8，ng/L，±s）

Tab.2 Four kinds of cytokines levels in the culture supernatant fluid of five groups表2 5组小鼠PMCs培养上清液中4种细胞因子的水平（n=8，ng/L，±s）

＊＊P＜0.01；A：空白对照组；B：阳性对照组；C：低剂量肾康干预组；D：中剂量肾康干预组；E：高剂量肾康干预组；a与A组比较，b与B组比较，c与C组比较，d与d组比较，P＜0.05

组别A组B组C组D组E组F TNF-α 96.9±12.3 238.8±21.4a 167.9±13.6ab 161.1±20.7ab 132.1±17.4abcd 72.236＊＊TGF-β1 50.6±11.1 139.8±13.4a 124.7±11.3ab 111.6±8.4abc 97.7±12.3abcd 71.443＊＊VEGF 79.4±12.3 152.7±18.8a 139.7±12.3a 133.7±12.5ab 115.2±14.1abcd 32.054＊＊CTGF 85.6±9.0 168.9±24.9a 157.2±17.0a 145.6±15.4ab 131.1±16.9abc 27.582＊＊

2.3 各组小鼠 PMCs中 TNF-α、TGF-β1、VEGF、CTGF的mRNA转录水平比较 与A组比较，B～E组TNF-α、TGF-β1、VEGF、CTGF mRNA水平均不同程度升高（P＜0.05）；与B组比较，C～E组各因子mRNA水平均下降（P＜0.05）；各组间各指标两两比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见表3。

Tab.3 mRNA relative transcription levels of 4 kinds of cytokines in cultured mouse PMCs表3 5组小鼠PMCs中4种细胞因子的mRNA相对转录水平 （n=8，±s）

Tab.3 mRNA relative transcription levels of 4 kinds of cytokines in cultured mouse PMCs表3 5组小鼠PMCs中4种细胞因子的mRNA相对转录水平 （n=8，±s）

＊＊P＜0.01；A：空白对照组；B：阳性对照组；C：低剂量肾康干预组；D：中剂量肾康干预组；E：高剂量肾康干预组；a与A组比较，b与B组比较，c与C组比较，d与D组比较，P＜0.05

组别A组B组C组D组E组F TNF-α 1.002±0.007 1.805±0.062a 1.537±0.051ab 1.443±0.051abc 1.300±0.029abcd 358.366＊＊TGF-β1 1.001±0.006 1.926±0.055a 1.603±0.059ab 1.506±0.035abc 1.413±0.035abcd 500.124＊＊VEGF 1.001±0.004 1.909±0.009a 1.609±0.024ab 1.497±0.039abc 1.440±0.032abcd 1310.114＊＊CTGF 1.001±0.004 1.935±0.027a 1.581±0.041ab 1.494±0.037abc 1.452±0.037abcd 878.687＊＊

3 讨论

PF是长期腹膜透析患者面临的问题，目前临床常采用药物干预、改进腹透技术、规范操作、预防感染、改善腹膜透析液的生物相容性等防治策略，近年来也开展了相关的基因治疗［5］。许多中药具有抗炎、抗纤维化的作用，被用于慢性肾脏病的治疗。中药对腹膜透析相关腹膜纤维化的防治备受关注。大黄的有效成分是大黄酸、大黄素等蒽醌衍生物。大黄素可抑制蛋白激酶通路的激活和cAMP反应元件结合蛋白（CREB）的磷酸化，减少高糖诱导的PMCs中TGF-β1的分泌，从而防治高糖诱导的腹膜结构和功能异常［6］。大黄酸具有抗氧化作用，一定浓度下可保护血管内皮细胞且无显著细胞毒性［7］。既往已有研究发现，以大黄为君药的肾康注射液可改善透析液诱导的腹膜功能减退和抑制氧化应激［8］。

腹透液的生物不相容性、腹膜炎或其他微炎症状态是腹膜纤维化的主要原因。腹膜纤维化时，纤维结缔组织增生，腹膜增厚，间皮细胞肿胀、变形、脱落，细胞间隙增宽，炎性细胞浸润，新生血管形成。间皮下基质和血管壁发生改变，影响腹膜转运功能，最终导致超滤失败。TNF-α、TGF-β1、VEGF、CTGF均是目前公认的在腹膜纤维化中起重要作用的细胞因子。TNF-α是一种炎性细胞因子，在腹膜纤维化过程中发挥着重要的作用［9］。腹透液的生物不相容性导致的无菌性炎症、缺氧和炎症状态可促进其表达及释放，并促进VEGF、IVAM-1、血管紧张素Ⅱ、IL-6和IL-8的表达。这些细胞因子激活纤维母细胞、肌纤维母细胞和内皮细胞，激活缺氧诱导因子（HIF-1α）通路，导致血管生长和纤维母细胞增生，最终导致腹膜纤维化［10］。目前认为，腹膜间皮细胞的上皮间充质转化（EMT）是腹膜纤维化的起点，并促进腹膜纤维化的发生发展，TGF-β1是整个过程的中心环节［11-12］，参与组织纤维化的整个进程。VEGF可促进全身各组织器官血管内皮细胞的生长、增殖，而血管生成和炎症正是腹膜纤维化发病机制的两条主线［13］。一方面，VEGF促进内皮增生和新生血管形成，增加了腹膜透析液体交换的有效面积。另一方面，腹膜血管的扩增和通透性的改变会增加小分子溶质的转运，最终使腹膜超滤功能受损。VEGF可促进腹膜组织糖尿病样微血管改变，加重腹膜组织的缺血性损伤，促进腹膜纤维化的发生发展。而使用抑制血管形成的药物内皮抑素肽可抑制VEGF的表达，减少纤维组织的增生，从而改善腹膜纤维化的进程［14］。CTGF是CCN家族成员，其过表达与增生性或纤维化性疾病密切相关，是许多致纤维化因子作用的共同介质，也是VEGF、TGF-β1重要的下游效应分子，介导了它们的致纤维化效应［15］。前期笔者的研究发现，一定浓度的肾康注射液可通过抑制 CAPD 小鼠 PMCs的 TNF-α、TGF-β1、VEGF、CTGF的表达，保护PMCs，从而控制腹膜纤维化发生发展［16］。

本研究通过体外细胞培养，观察肾康注射液对高浓度葡萄糖诱导的TNF-α、TGF-β1、VEGF、CTGF的表达的影响。小鼠PMCs为上皮来源，贴壁生长，本研究选择低糖型（低于1.0 g/L）DMEM作为培养液，不加任何处理为空白对照组。目前认为高浓度葡萄糖可诱导细胞因子的释放，刺激PMCs基质增生和间皮细胞凋亡脱落，促进腹膜纤维化的发生［17-18］。按照2.5%腹膜透析液中葡萄糖浓度计算，并参考文献［19］中细胞能够耐受的葡萄糖浓度，选择DMEM+140 mmol/L葡萄糖作为阳性对照。实验组细胞培养液中再分别加入不同浓度的肾康注射液。结果显示：与空白对照组比较，高糖可诱导TNF-α、TGF-β 1、VEGF、CTGF等细胞因子水平的显著升高（P＜0.05），当细胞培养液中加入肾康注射液后，由高糖诱导的TNF-α、TGF-β1、VEGF、CTGF等细胞因子水平较阳性对照组均有不同程度下降。另外，与空白对照组比较，高糖可诱导这4种细胞因子的mRNA表达显著升高，当加入肾康注射液后，各细胞因子mRNA水平仍有升高，但与阳性对照组比较，呈逐渐降低趋势。结合对蛋白质水平的影响，笔者推测肾康注射液可以抑制体外培养小鼠PMCs与腹膜纤维化密切相关的细胞因子TNF-α、TGF-β1、VEGF、CTGF的释放，并以剂量或浓度依赖的方式，通过抑制由高糖诱导的小鼠 PMCs中 TNF-α、TGF-β1、VEGF、CTGF的表达和转录，实现对小鼠PMCs的保护。

肾康注射液标本兼顾，以祛邪为主，活血扶正为辅，组方科学合理。关于其抑制PMCs TGF-β1、CTGF等致纤维化细胞因子的表达和转录的机制尚不清楚。最近研究发现，由于炎症和血管生成导致腹膜纤维化的主要分子机制可能与包括Toll样受体-配体介导、NOD-样受体蛋白3/IL-1β、VEGF以及血管生成素2/Tie2信号通路有关［13］。研究还发现，对诱导腹膜纤维化和随后的腹膜功能失调起重要作用的EMT主要由TGF-β1家族成员以及Toll样/IL-1β受体传递信号［20］。肾康注射液是通过其中的哪个或哪些途径对腹膜功能进行保护，从而抑制腹膜透析相关腹膜纤维化的发生发展尚不明确，关于机制的研究今后仍需进一步深入探索，以期为腹膜透析相关腹膜纤维化的防治提供理论基础。