高效液相色谱法测定消渴灵片中盐酸小檗碱含量

刘敏楠

(谢菲尔德大学,英国 S10 2TN)

消渴灵片是临床常用的消渴病治疗药物,具有气阴双补、清热止渴功效,适用于消渴病气阴两虚型,典型临床表现包括多饮多食多尿、体重下降,气短,全身乏力。现代医学中并无消渴病名,根据病因病机及临床表现可归属于“糖尿病”,多属于2型糖尿病[1-2]。黄连是消渴灵片组方中不可或缺的组成部分,其主要有效成分是盐酸小檗碱,即通常意义上的黄连素,具有清热泻火、止渴燥湿的功效[3]。盐酸小檗碱属于一种生物碱,具有抑菌作用,能够有效清除毒素[4]。本次研究选择Dionex Ultimate3000型色谱仪,分别选择Acclaim SEC-300及MAbPac SEC-1色谱柱,经由体积排阻色谱法进行检测,分析检测结果,获得一定研究成果,现报告如下。

1 资料与方法

1.1 设备与试剂

本次研究选择Dionex Ultimate3000(Thermo Scientific制造)型色谱仪,分别选择Acclaim SEC-300(5μm,分析范围4.6×300mm,由Thermo Scientific制造)及MAbPac SEC-1色谱柱(5μm,分析范围2.1×300mm,由Thermo Scientific制造),浓度测量仪器为Nanodrop2000(Thermo Scientific制造),离心机为Thermo Legend Micro17离心机,20μL环形Nano Viper/彩色PEEK管(内部直径为0.18mm),震荡搅拌机,Mettler toledo 320 pH计;主要化学试剂如下：HPLC梯度级水(Fisher Scientific制造,英国),HPLC级乙腈(Fisher Scientific制造,英国),P4417 SIGMA磷酸盐缓冲盐水(片剂,一片溶于200mlHPLC水中,得到0.01M磷酸盐缓冲液);盐酸小檗碱(产品编号GZDD-0060,CAS号633-65-8,质地纯度≥98.837%,来自贵州迪大科技有限责任公司,常规包装30mg),消渴灵片(国药准字Z22023834,由四平市吉特药业有限公司生产,0.36g/片)。

1.2 方法

本次研究选择Acclaim SEC-300及MAbPac SEC-1色谱柱,其直径分别为4.6×300mm、2.1×30mm,流速分别为≤0.35ml/min、0.05-0.075ml/min,柱温分别为＜60℃、20-25℃,pH范围分别为2-12、2.5-7.5,流量参数分别0.3ml/min、0.075ml/min,平衡时间分别为50min、42min;给予HPLC级乙腈、HPLC梯度级水以及P4417SIGMA磷酸盐缓冲盐水(0.01M),检测波长260nm,经由体积排阻色谱法进行检测,分析检测结果。检测方法如下：(1)吸取HPLC梯度级水(5μL)转移至设备顶部,合上装置臂,再次打开后,擦拭顶部HPL C梯度级水,重复2-5次,保证设备顶部足够干净。(2)进入系统设置后,选择计算机系统中的寡核苷酸计算模式,输入序列后,得到分子量及分子退出系数等实验基础参数;(3)测试盐酸小檗碱样品前,以2μL HPLC梯度水作为实验的空白对照组,开始样品浓度测试,每次吸取样品2 μL;实验结束后,仪器顶部同样使用HPLC梯度级水清洗;准备好样品(单个样品总体积500 μl,最大浓度400pmol/μl)、制备缓冲液,设定浓度为5pmol/μl;-20℃条件下保存于冰冻箱内;检测时,将样本取出后放置于室温下,直至样品完全融化后,经涡旋混合器混合、经离心5min后,去除气泡,再继续其余实验步骤;层析寡核苷酸样品,自动取样针依次吸取P BS缓冲液、盐酸小檗碱样品、P BS缓冲液;每个缓冲液均需在脱气15min后再与色谱系统相连,在实验中持续关注P B S缓冲液情况,P B S缓冲液需及时更换,但不得中断,保证色谱柱不干燥。

2 结果

盐酸小檗碱在40.371-215.109pmol/μL浓度范围内与峰高之间存在线性关系,R2=0.9302,方程y=5.069x-14.172。

3 讨论

3.1 消渴灵片与盐酸小檗碱

消渴灵片主要组成部分包括人参、黄芪、枸杞、五倍子、葛根、知母等诸中药,其主要临床表现多为全身乏力,多饮多食多尿等[5]。消渴病在现代医学中并无此病名,而是根据其病因病机及临床表现归属于糖尿病。而糖尿病是临床常见的慢性内分泌系统疾病,以持续高血糖为主要临床表现,多经药物治疗,代表药物包括二甲双胍、胰岛素、格列齐特等,能够有效降低血糖,有助于减轻患者糖耐量受损程度。黄连是消渴灵组方中的君药,其主要有效成分是指盐酸小檗碱,具有抗炎、抑菌等功效[6]。由于盐酸小檗碱具有清热、解毒、抗炎止血等作用,与治疗气阴两虚型消渴病的消渴灵片功效关联密切,因此将盐酸小檗碱作为评估消渴灵片质量的重要控制指标非常合理,具有非常重要的临床意义。

3.2 高效液相色谱法与样本检测

盐酸小檗碱多用于霍乱弧菌属细菌、志贺菌属细菌等致病菌导致的感染性肠道疾病,其检测方法较多,如紫外-可见分光光度法、二阶导数光谱法、薄层扫描法及高效液相色谱法等,其中以高效液相色谱法应用率最高,该方法具有重复性好、层析速度快、分离效率高、特异性较好等优势,在药物分析中应用范围广泛。本次研究中以消渴灵片为盐酸小檗碱样本来源,制定样品及缓冲液后,经由体积排阻色谱法进行检测,结果显示：本次研究样品的盐酸小檗碱在40.371-215.109pmol/μL浓度范围内与峰高之间存在良好的线性关系,R2=0.9302,方程y=5.069x-14.172。

4 结语

总之,采用高效液相色谱法检测盐酸小檗碱,具有线性关系良好、操作便捷、准确等优势,有助于控制消渴灵片质量,值得进一步在临床应用及推广。

[1] 薛非凡,曾丽,王丽玉,等.消渴灵片质量标准研究[J].中国药师,2013,16(11)：1641-1644.

[2] 蒋叔霏.高效液相色谱法测定消渴灵片中盐酸小檗碱含量[J].安徽医药,2012,16(6)：766-767.

[3] 杨冬梅,张毅,刘俊,等.不同溶媒在不同提取方法下对吴茱萸碱提取率的影响[J].安徽医药,2012,16(6)：765-766.

[4] 董海彦.连蒲双清片含量均匀度的考察[J].华西药学杂志,2014,29(4)：478-479.

[5] 赵严丽,陈淑娟.高效液相色谱法测定消渴平胶囊中盐酸小檗碱含量[J].中国药业,2014,23(1)：10-11.

[6] 魏世超,徐丽君,邹欣,等.黄连粉末中盐酸小檗碱及盐酸药根碱的体内肠吸收特性[J].华中科技大学学报(医学版),2013,42(3)：333-337.