实验室里的大肠杆菌进化实验

吴平华

(华中科技大学附属中学 武汉 430000)

生物进化作为事实，已经被古生物学、比较解剖学、胚胎学等生物分支学科所证实，但由于生物进化时间极其漫长，人们很难直接观察、记录自然界中生物进化的机理和过程，故只能通过观察进化的现象和结果加以推测。

那么，能否在实验室里设计出科学的进化实验来揭示进化机理呢？1988年，美国密歇根州立大学的进化生物学家理查德·伦斯基(Richard Lenski)以大肠杆菌为实验材料，设计了一个在实验室里长久运行的进化实验[1]。

1 实验简介

1.1 实验选材 伦斯基以大肠杆菌为实验对象，原因是大肠杆菌的繁殖周期短，可以极大地节省整个实验的时间。大肠杆菌在营养充足、培养条件适宜、无天敌的理想条件下，约20min繁殖一代。在伦斯基设定的实验条件下，大肠杆菌每天繁殖约6.6代。自1988年实验启动至今，其大肠杆菌已经繁殖了6万多代。若以一年繁殖一代的生物为研究对象，则需要6万多年才能繁殖这么多次，如果是人类则需要一百多万年的漫长岁月。

1.2 大肠杆菌培养基 伦斯基根据实验的需要，对细菌普通培养基的成分进行了调整： ①以微量葡萄糖作为大肠杆菌的能源物质。葡萄糖的浓度为25mg/L,仅为细菌普通培养基中葡萄糖含量的1%，目的是观察大肠杆菌会进化出怎样的高效代谢葡萄糖的能力。②培养基中额外添加了大量的柠檬酸盐，其含量达到葡萄糖浓度的十多倍。加入柠檬酸盐的目的是为了方便监测大肠杆菌在培养过程中是否被杂菌污染。因为在有氧条件下，大肠杆菌不能代谢柠檬酸盐。若有杂菌污染，柠檬酸盐会被分解，从而被观测到。

1.3 实验过程 伦斯基将单个大肠杆菌加以繁殖，然后接种于12瓶培养基中进行培养，从而形成12个遗传基因完全相同的菌株。这12个瓶子对这些大肠杆菌来说，相当于12个完全彼此独立的世界。大肠杆菌利用瓶中的资源进行生长、繁殖。随着瓶中葡萄糖的逐渐消耗，大肠杆菌的生长、繁殖便逐渐减慢以至停止，24h后大肠杆菌的种群密度基本趋于一个稳定的常数值。此后的每一天，12个菌株每天每瓶被取出1%，分别接种至12瓶新的、相同的培养基中培养。每隔75d，大肠杆菌繁殖约500代，菌株样本便被冷冻保存起来。这样就创建了一个完备的人工“化石记录”，使研究者能够追溯或重演大肠杆菌的进化历程。

实验持续进行至今，积累的冷藏样本已经超过4000瓶。这些样本包括实验开始时的菌株以及最近的菌株。

2 实验成果

到目前为止，伦斯基团队已经发表论文50多篇。其成果主要有：

2.1 让人们见证了细菌新品种的诞生 大肠杆菌在繁殖约3.15万代时，12个菌株中的一个菌株进化出了以柠檬酸盐为食的超能力，这种突变的意义巨大。人们更感兴趣的是，食柠檬酸盐“超能力”的进化机理是什么？

伦斯基团队用冷藏的样本重演了进化历程。结果显示大肠杆菌在2万代或更早时开始产生变异。变异再经过1.15万代的积累,最终才进化出食柠檬酸盐的“超能力”。

随着基因测序技术的进步，伦斯基及时将基因测序手段引入到实验中。目前，伦斯基团队测定了来自12个菌株的264个完整的基因组DNA序列，通过对比分析，终于揭示了食柠檬酸盐的进化机理[2]： 在原始菌株的基因组中，柠檬酸盐转运子基因(citratefermentation，简称citT)与相关基因citG、ma、mk呈线性排列(图1)。

在有氧条件下citT不表达。而突变菌株的基因组中有一段2933bp的DNA片段出现了重复，使citG、citT、ma和部分的mk发生了倍增(图2)。尤其关键的是：mk插在citT之前的同时，mk的启动子取代了citT的启动子，使citT由沉默状态变成可表达状态，而citT的表达产物就是运输柠檬酸盐的载体蛋白质——柠檬酸盐转运子，其功能是将柠檬酸盐运输到细胞内。之后的变异进一步增强了该转运子的运输效率，最终食柠檬酸盐的菌株便出现了。

2.2 证实生物的进化永远不会停滞 起初，科学家推测，只要环境因素保持稳定不变，生物就能形成一个适应状态，当达到适应的顶峰后，生物的进化就会停止。伦斯基团队对12个菌株的适应性都进行了检测。检测涵盖了整个进化历程的所有时间点。结果发现在繁殖约1万代时，大肠杆菌似乎达到了适应的顶峰。然而经过多达5万代的增殖，虽然大肠杆菌进化的速度有所减缓，但并未如人们预期的那样停滞下来。这说明即使在一个稳定不变的环境中，生物的进化也永远不会停滞。

2.3 证实古尔德的生物进化观点是正确的 史蒂芬·古尔德(Stephen Jay Gould)是美国著名的古生物学家、科普作家。他在研究软体动物进化时提出了进化是不可复制的理论： 如果再给一次进化的机会，生物的进化会朝另外的方向进行。当时，多数学者认为他的观点是错误的。而伦斯基一直都对该理论持有很高的兴趣。伦斯基的进化实验显示，12个菌株的进化具有共同的趋势： 都进化出了更大的细胞、更快的生长速度和较低的种群密度峰值。这似乎说明进化是可复制的，但其实这是相同的环境条件导致趋同进化的结果。

例如，鱼类、鲸类适应水生环境，虽然都进化形成了相同的体型、鳍、尾等，但它们的进化历程肯定是不同的。伦斯基检测了12个菌株的多达1.4万个基因突变，结果显示： 每个菌株的变异频率都不相同，每个菌株的变异方式也不相同。例如，其中只有一个菌株产生了在有氧条件下代谢柠檬酸盐的超能力变异,而其他11个菌株则没有出现此种能力。

这足以证明古尔德的理论是正确性的，进化的确是不可复制的。

3 实验争鸣

伦斯基的进化实验引发的争议主要有以下两个方面。

3.1 进化是注定的还是偶然的 12个菌株的初始基因是相同的。经历长期的进化，最终只有1个菌株进化出代谢柠檬酸盐的超能力，说明各个菌株进化的历程是不相同的。即进化是偶然的而非注定的。

伦斯基选取有氧代谢柠檬酸盐菌株的祖先进行进化史的重演实验，结果为： 0～15000代祖先无一例成功，20000～30000代祖先有4例成功，30500～32500代祖先有13例成功。

结果表明，越是遥远的祖先，进化成功的可能性越低，而越是年轻的祖先，进化成功的可能性越高。这说明进化出有氧代谢柠檬酸盐的能力并非是一个单纯的、幸运的突变，而是需要一定的变异累积。故进化也不完全是偶然的。

3.2 大肠杆菌的进化模式是否适用于其他物种的生物 有学者怀疑别的物种也有与大肠杆菌相似的进化模式。已经有研究者以酵母菌等进行了类似的进化实验，但由于其工作量较伦斯基低好几个数量级，故无法提供足够的实验数据对这种怀疑予以证实。

4 实验启示

伦斯基的实验自1988年启动，一直默默无闻地持续进行着，近30年的不懈努力，研究终于有所突破。伦斯基的进化实验启示我们： 只有抛弃急功近利的短视思维，努力地工作、默默地求索，才有可能在科研上取得些许进步和成果。