丝素蛋白的磷酸化及其仿生矿化膜的制备

周 倩， 袁久刚， 李 澜， 王 平， 王 强

(生态纺织教育部重点实验室(江南大学)， 江苏 无锡 214122)

丝素蛋白不仅可用作纤维原料，因其良好的生物相容性，在生物材料制备中也有潜在用途[1]。为拓宽丝素在生物材料及医学领域中的应用，不少研究者采用化学或生物的方法进行丝素改性加工，如采用辣根过氧化物酶(HRP酶)催化丝素接枝丙烯酸，加速矿化中丝素表面钙盐沉积，制备仿生矿化材料[2]；采用磷酸进行丝素磷酸化，赋予丝素膜抗凝血性，用于制作止血材料等[3]。

羟基磷灰石在自然界中主要由钙磷灰石(Ca5(PO4)3(OH))自然矿物化形成，羟基磷灰石具有优良的生物相容性和生物活性，可作为骨骼或牙齿的诱导因子被用于骨修复手术中。在生物材料表面生成羟基磷灰石的方法有很多种，按照矿化液的不同大致可分为3类：模拟体液法、交替矿化法和过饱和钙化溶液法[4]。

本文采用三聚磷酸钠作为磷酸化试剂对丝素蛋白进行磷酸化，其机制是：丝素蛋白中丝氨酸(Ser)、酪氨酸(Tyr)的羟基和赖氨酸(Lys)的氨基与无机磷发生酯化反应，形成C—O—P和C—N—P的结构[5]。在磷酸化的丝素膜材料基础上进行仿生矿化，诱导羟基磷灰石的形成，实现丝素基仿生矿化材料的制备。

1 实验部分

1.1 实验材料

桑蚕丝练白绸(35.5 g/m2，江苏鑫缘茧丝绸有限公司)；三聚磷酸钠(STP)、一水溴化锂、无水氯化钙、无水乙醇、十二水磷酸氢二钠、对二苯酚、钼酸铵、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、盐酸等试剂(分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1丝素溶液的制备

将桑蚕丝练白绸溶解在溴化锂/无水乙醇/水(物质的量比为1∶1∶2)体系中，在75 ℃条件下搅拌2 h得到丝素(SF)溶液，用去离子水对丝素溶液进行透析，直至透析液电导率值小于4 μS/cm，再将丝素溶液离心去除不溶物，以称量法标定上清液浓度，将丝素溶液在4 ℃条件下保存。

1.2.2丝素的磷酸化

分别取40 g/L的丝素蛋白溶液各30 mL, 用1 mol/L NaOH溶液调节溶液pH值分别为8、9、10。在35 ℃作用下，缓慢加入0.24 g三聚磷酸钠反应30 min，反应过程中用NaOH溶液调节pH值使其保持在加入STP前的固定值。反应结束后冷却，调节溶液pH值至中性。为探究STP的用量对丝素磷酸化的影响，同样条件下控制pH值为10，温度为35 ℃，分别加入质量分别为0.06、0.24 g的STP(不同质量的STP与SF反应后的溶液分别标记为SF-1, SF-2)，反应30 min。

1.2.3丝素膜的制备

风干膜制备：将STP磷酸化后的丝素溶液中加入0.125 g甘油，混合均匀后将其转移至聚四氟乙烯模具中，在恒温恒湿箱中以流延法制备风干膜。

冻干膜制备:将STP质量分别为0.06、0.24 g的磷酸化后的丝素溶液进行透析。透析完毕后将溶液在-50 ℃冷冻干燥成膜，将冻干膜在50%乙醇醇化处理4 h后再次冻干(不同质量的STP与SF反应后的膜分别标记为SF-1膜，SF-2膜)。

1.2.4丝素/羟基磷灰石复合材料的制备

丝素/羟基磷灰石复合材料采用交替矿化法制备[6]。分别取未处理丝素冻干膜和磷酸化丝素冻干膜，用CaCl2/Tris-HCl溶液(CaCl2浓度为500 mmol/L；Tris-HCl浓度为50 mmol/L，pH值为7.45)进行钙化，先在37 ℃下处理30 min，以去离子水水洗后，再将样品浸渍在Na2HPO4/Tris-HCl (Na2HPO4浓度为300 mmol/L；Tris-HCl浓度为50 mmol/L，pH值为8.50)溶液中，在37 ℃下处理30 min，然后用去离子水水洗。上述过程被定为1个Ca-P矿化周期，重复7个周期直至结束。作为对比，磷酸化丝素膜只用CaCl2处理，不加Na2HPO4。不同矿化的处理条件如表1所示。

表1 不同矿化处理条件Tab.1 Different mineralization conditions of silk membranes

1.3 分析测试方法

1.3.1磷含量的测定

依据GB 12393—1990《食物中磷的测定方法》，采用磷钼蓝比色法[7]测定磷含量，原理为：无机磷元素在酸性溶液中会与钼酸铵结合生成磷钼酸铵，经对苯二酚、亚硫酸钠还原磷钼酸铵后会形成蓝色化合物钼蓝,其最大吸收波长是660 nm。

磷标准曲线的绘制：分别吸取1～5标准液(磷标准液用磷酸氢二钾配制，质量浓度为1 mg/mL)至50 mL刻度试管中，然后依次加入2 mL质量分数为5%的钼酸铵溶液、1 mL质量分数为20%的亚硫酸钠溶液、1 mL质量分数为0.5%的对苯二酚溶液，加水定容到20 mL，摇晃试管使溶液混合均匀，再静置30 min。测定溶液660 nm处的吸光度，以标准液质量浓度C(mg/mL)为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程y=0.053 6x+0.089 5，R2=0.996 23。

取反应后溶液5 mL，加入15 mL三氯乙酸溶液(2 mol/L)沉淀丝素蛋白，静置一段时间后离心，取上层清液2 mL及同样的空白溶液，分别置于20 mL具塞试管中，其余操作同标准曲线，磷转移量以磷酸化后体系中磷质量浓度的降低率表示。

1.3.2圆二色谱和粒径测试

通过圆二色光谱仪检测丝素溶液二级结构的变化，取丝素样品加入到1 mm 比色皿中，检测波长范围为195～250 nm，扫描速度为100 nm/min。使用粒径及Zeta 电位分析仪测定25 ℃条件下丝素溶液的粒径大小和粒径分布。

1.3.3化学结构分析

采用Nicolet iS 10傅里叶红外光谱仪(FT-IR)的全反射(ATR)模式，在扫描范围为4 000～650 cm-1内对不同的冷冻干燥膜样品进行红外光谱分析。扫描次数为32，分辨率为4 cm-1。

1.3.4丝素膜对阳离子的吸附效果

以阳离子染料进行丝素膜沾色实验，沾色工艺条件：温度为85 ℃，处理时间为30 min，浴比为1∶100，其中染料质量浓度为0.2 g/L。吸附能力以沾色率表示，即膜材料沾色前后染液吸光度的变化率。

1.3.5断裂强度测试

采用YG141型织物厚度仪测定丝素风干膜厚度，采用万能材料试验机测定膜的力学性能，拉伸速度为40 mm/min，夹距为40 mm。测试前将样品裁剪成尺寸为80 mm×5 mm的样条，并在恒温恒湿箱(温度为20 ℃，相对湿度为65%)中平衡24 h，每个样品进行10次重复实验，样品断裂强度和断裂伸长率分别由以下公式计算：

式中：Q为断裂强度，MPa；P为强力，N；d为厚度，mm；b为膜宽度，mm；ε为断裂伸长率，%；L′为伸长，mm；L为原长，mm。

1.3.6热力学性能测试

使用Q200型差示扫描量热仪测定不同条件处理后的丝素冻干膜。测试条件：样品质量为5 mg，升温速度为10 ℃/min，升温范围为100～400 ℃，氮气流量为50.0 mL/min。

1.3.7表面元素测试

将样品置于能量色散X射线能谱仪中分别进行线扫描和面扫描，测试出丝素膜表面元素含量和分布[8]。

1.3.8形貌观察

使用SU1510型扫描电子显微镜观察所制备的丝素材料的表观形态结构，样品经过喷金处理，扫描加速电压为5 kV。

2 结果与讨论

2.1 pH值和STP质量对磷酸化程度影响

磷转移量一定程度上反映丝素蛋白的磷酸化效果，采用磷钼蓝比色法测得：当pH值分别为8、9、10时，磷转移量分别为35.5%、42.3%、67.1%。在pH值为8时磷转移率最低，在pH值为10时磷转移率最高。pH值较低时，磷酸根主要与赖氨酸反应，但丝素中赖氨酸含量很低，因此磷酸化程度就低。当碱性增强时，Ser—OH电离成Ser—O-，此时亲核取代效应增强，游离的磷酸根基团与Ser—O-基团反应，氨基酸残基侧链中的羟基活性会变得越来越高[9]，丝素蛋白磷酸化程度增加。

图1示出不同质量的STP对磷酸化程度的影响。当STP质量较低时，随着STP质量的增加，磷酸化程度显著增加；当STP质量达0.12 g时，磷酸化程度趋于稳定。这表明磷酸根较少时，不是所有氨基酸残基都能够参加反应，有些可能因空间位阻和所处的化学环境限制了其反应[10]。当磷酸根足够多时，氨基酸残基能充分反应，磷酸化程度最大并趋于稳定。

图1 不同质量的STP对磷酸化程度的影响Fig.1 Effect of mass of STP on phosphorylation

2.2 磷酸化对丝素蛋白结构和粒径的影响

采用圆二色谱考察了丝素经过磷酸化后二级结构的变化，结果见图2。可看出，丝素溶液在220 nm处有负峰，这说明丝素蛋白的二级结构以α螺旋为主[11]。当用STP处理后，220 nm 处负峰强度增大，表明丝素蛋白的二级结构发生了变化。通过计算得到丝素蛋白二级结构的分布，见表2。

由表2可知，SF的螺旋结构最少，无序度最高。当用STP处理SF后，其样品的螺旋结构都增加了，无规卷曲都有不同程度的减少，即磷酸化使得丝素的结构更加完整，这也为后续的丝素膜材料构建奠定了良好的结构基础。

图2 STP处理后丝素溶液的圆二色谱图Fig.2 Circular dichroism of silk fibroin solution after STP treatment

%

由表2还可看出，当STP质量为0.06 g时，其螺旋结构最多，无规卷曲最少，即适度的磷酸化对丝素蛋白结构影响较大。

为进一步验证磷酸化对丝素溶液粒径产生的影响，测定了反应前后丝素溶液的粒径分布变化，结果如图3所示。可以看出，3组样品的主要粒径分布范围在100～250 nm之间，其中SF的平均粒径和多分散性指数(PDI)分别为143.5 nm和0.528。当用STP处理SF 溶液后，粒径分布都有不同程度的增大。STP质量为0.06 g时，平均粒径和PDI分别为158.5 nm和0.566；而当STP质量为0.24 g时，丝素溶液的平均粒径增大到171.5 nm，PDI为0.615。这是因为磷酸根的引入使得丝素溶液间的静电斥力增加，使得粒径分布增加。

图3 STP处理后丝素溶液的粒径分布Fig.3 Size distribution of fibroin solution after STP treatment

2.3 磷酸化丝素化学结构分析

为进一步证明丝素中氨基酸与STP发生反应的结构变化，利用红外光谱仪的全反射模式对不同处理条件的丝素膜进行测试，其结果如图4所示。可以看出，丝素蛋白的特征酰胺键主要分布在1 654、1 513 cm-1附近，表明经过冷冻干燥后的再生丝素蛋白材料以无定形结构为主[12]。STP中磷酸根的特征峰在896 cm-1处，丝素经过STP处理后，在921 cm-1处有新峰，其位置对应是P—O键的伸缩振动峰[13]，即证明丝素成功被STP磷酸化。

图4 磷酸化的丝素冻干膜ATR-FT-IR光谱图Fig.4 ATR-FT-IR spectra of phosphorylated silk fibroin

2.4 磷酸化丝素膜对阳离子的吸附效果

磷酸化影响丝素蛋白表面电荷分布，使得丝素蛋白分子表面负电性基团增多。借助阳离子染料沾色实验，探究磷酸化丝素表面对阳离子的吸附。结果发现，STP质量为0、0.06、0.24 g时对应的沾色率分别为9.3%、16.2%、31.8%。磷酸化会在蛋白质分子中引入负电性磷酸根基团，阳离子染料带正电，与丝素间结合力主要为库仑引力。根据丝素膜表面沾色率变化，可判别出丝素膜磷酸化的程度。当STP质量为0.24 g时,丝素对染料的沾色率增至31.8%，表明丝素磷酸化有利于膜表面阳离子的吸附，为后续丝素表面钙磷酸盐的吸附和沉积奠定了基础。

2.5 磷酸化对丝素热力学和力学性能影响

为深入分析磷酸化对丝素膜材料热力学性能的影响，采用差示扫描量热仪分析丝素膜的热力学转变温度，结果如图5所示。可以看出，SF蛋白膜存在3个明显的吸热峰，其中在50、121 ℃附近的吸热峰分别是由于自由水和结合水的蒸发引起的，在278 ℃附近的吸热峰则是由于丝素蛋白膜材料热降解引起的，该温度为丝素蛋白的热分解温度[14]。经过STP处理后的SF膜，丝素蛋白的热性能发生了较小的变化，但从图5可看出，当温度升高到285 ℃左右以后，经过磷酸化的SF膜完全被降解，可见STP的引入使得SF膜的热稳定性有所下降。原因是：磷酸根的引入使得丝素蛋白质分子间的氢键被大量破坏，引入大量负电基团使静电斥力加大，从而导致样品的热性能急剧降低。

图5 磷酸化丝素膜的DSC曲线Fig.5 DSC curves of phosphorylated silk fibroin membranes

为探究丝素磷酸化对风干膜材料力学性能的影响，测定了丝素风干膜的断裂强度和断裂伸长率，结果如图6所示。可以看出：当STP质量为0.06 g时，对应的样品断裂强度和断裂伸长率最高；当STP质量为0.24 g，所对应的样品断裂强度、断裂伸长率最低。当STP质量为0.24 g时，样品断裂强度下降，这是因为在磷酸化过程中，蛋白分子中羟基或氨基磷酸化后，不仅使分子间氢键减少，且引入的负电磷酸根基团加大了蛋白分子间的静电斥力。当STP质量为0.06 g时，样品断裂强度比原样稍有提高。从丝素二级结构可看出，丝素蛋白经0.06 g STP处理后，无序度最低，且螺旋结构变多，使得力学性能增加，即抵消了磷酸化对膜材料强力的消极影响。

图6 磷酸化丝素膜的力学性能Fig.6 Mechanical properties of phosphorylated silk fibroin membranes

2.6 仿生矿化膜表面元素和形貌分析

采用能量色散X射线能谱仪分析经过仿生矿化丝素膜表面不同元素的含量，其结果如表3所示。当SF经STP处理后，引入了部分磷酸根，因此将磷酸化后的丝素膜只用CaCl2处理时，其中Ca元素和P元素含量随着磷酸化程度的提高而增加，其中P元素的引入都是STP磷酸化导致的，也因此间接反映磷酸化程度。当用CaCl2/Na2HPO4对磷酸化的丝素膜进行仿生矿化后，Ca元素和P元素含量都相比只用CaCl2矿化的丝素膜高。

表3 仿生矿化后的丝素膜表面元素含量Tab.3 Element contents of silk fibroin membrane surfaces after bionic mineralizction %

为更直观地观测丝素膜矿化后的变化，借助扫描电镜对各个丝素膜的形貌变化进行观察，结果如图7所示。

图7 不同矿化条件下丝素膜的形态结构(×300)Fig.7 Morphological structures of silk membranes under different mineralization conditions(×300)

从图7可看出，未经磷酸化处理的SF膜表面很光滑，经过CaCl2/Na2HPO4交替矿化处理的SF膜表面变得很粗糙，有少量颗粒状无机物生成，表明有磷酸钙盐或羟基磷灰石晶体生成，但其分布并不均匀。随着磷酸化程度增加，SF/STP处理膜表面生成的羟基磷灰石晶体逐渐增多，且分布较均匀。矿化过程中用CaCl2/Na2HPO4处理的丝素膜表面生成的羟基磷灰石数目比仅用CaCl2处理的丝素膜要多，即丝素经STP磷酸化后，提供了部分的磷酸根，从而为矿化过程提供了更多的沉积位点。

3 结 论

1)丝素蛋白在三聚磷酸钠质量为0.24 g、pH值为10、35 ℃条件下处理30 min，获得了较好的磷酸化效果；丝素经过磷酸化处理后，蛋白二级结构和分子粒径发生变化，磷酸化丝素膜对阳离子的吸附能力较空白样增加。

2)采用三聚磷酸钠作为磷酸化试剂对丝素蛋白的力学与热稳定性有影响，当磷酸化程度较高时，丝素膜材料的力学与热力学性能发生不同程度的下降。

3)磷酸化丝素膜经CaCl2/Na2HPO4交替矿化处理后，其表面较空白样生成更多羟基磷灰石，采用三聚磷酸钠作为磷酸化试剂有利于丝素基仿生矿化材料的制备。

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