孕中期宫颈阴道分泌物中IL-6、TNF-α和CRH的水平与早产的关系

丁晓颖，蔡 燕，杨慧琳，邢秋霞，陆玲玲，程妤奋，沈丽华，黄 鹰

(上海市浦东新区妇幼保健院妇产科，上海 201206)

早产是现代产科面临的主要挑战之一，每年出生的早产儿已达1 500万，是新生儿死亡的主要原因，且存活的早产儿中部分遗留智力障碍或神经系统后遗症，给社会和家庭造成极大的负担。目前全球早产平均发生率约为10%，高居妊娠并发症榜首[1]。随着我国二胎政策的开放，早产儿的数量预计将进一步升高，早产已是亟待解决的世界性难题。越来越多的研究表明，分娩的启动类似于一个炎症反应，越早出现的早产越可能是感染所致[2]，白细胞介素(interleukin，IL)-1β，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α等多种炎症介质参与其中[3]。其中，IL-6的相关研究较受关注[4]，但以羊水和血液样本研究为主；促肾上腺激素释放激素(corticotrophin-releasing hormone，CRH)则国内研究的文献较少。本研究采用更容易为孕妇接受的宫颈阴道分泌物为研究样本，用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测孕中期妇女多种炎性因子和CRH的水平及其相关性，为早产的预测和防治提供更新更为全面的理论依据。

1资料与方法

1.1一般资料

选择2015年1月至2017年12月在上海浦东新区妇幼保健院正规产检的孕产妇，无吸烟喝酒等不良嗜好，既往无宫颈机能不全史，无高血压、糖尿病、牙周病和上呼吸道感染等合并症。在孕24～28周，孕妇签署告知同意书后，进行宫颈阴道分泌物采样冻存待测，并随访其妊娠结局。随机抽取早产100例作为研究组，其中自发性早产71例，胎膜早破早产29例；足月产100例为对照组，两组分娩方式均为经阴道分娩。早产诊断标准：妊娠满28周至不足37周分娩者[5]。

1.2方法

1.2.1标本采集及处理

所有研究对象在孕24～28周产检时，无痛碘消毒外阴，窥阴器撑开阴道暴露宫颈，用无菌棉拭子置于宫颈管及后穹窿部停留约10s以充分吸取宫颈阴道分泌物，后立即将棉拭子放入2mL pH =7.4的磷酸盐缓冲液中漂洗，2 000r/min离心5min后取上清液，分置于3个Dacon管中于-20℃冰箱冻存待测。取样前一周禁止性生活。

1.2.2 IL-6、TNF-α和CRH水平的测定

①用双抗体夹心ABC-ELISA法检测IL-6、TNF-α和CRH的浓度(试剂盒由上海西唐生物科技有限公司提供)；②试剂盒及待测样品提前从冰箱中取出，平衡至室温；③加样，每孔各加入标准品或待测样品100μL，将反应板充分混匀后置于37℃下40min；④洗板5次，向滤纸上印干(洗板机有芬兰Thermo公司提供)；⑤洗板5次，每孔加酶标抗体工作液100μL，将反应板放置在37℃下10min；⑥再洗板5次，每孔加入底物工作液100μL，置于37℃暗处反应15min；⑦每孔加入100μL终止液混匀，30min内用酶标仪(由芬兰Thermo公司提供)在450nm处测吸光值。

以标准品400、200、100、50、25、12.5、6.25、0pg/mL为横坐标，OD值为纵坐标，使用软件作图，画出标准曲线，根据样品OD值计算出相应IL-6、TNF-α和CRH含量，再乘以稀释倍数即可。

1.3统计学方法

应用SPSS 21.0统计软件包对各组数据进行分析，计量资料以均数±标准差表示，方差齐性分析采用t检验，IL-6、TNF-α浓度与CRH水平之间的关系用线性相关系数R2表达，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异显著统计学意义。

2结果

2.1一般资料比较

两组研究对象在年龄、体质量指数(BMI)、采样孕周等因素进行比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表1。

表1 两组孕产妇一般资料比较

2.2两组孕24～28周宫颈阴道分泌物中IL-6、TNF-α和CRH的水平比较

两组比较，早产组孕24～28周宫颈阴道分泌物中炎性因子IL-6、TNF-α和CRH的水平都显著高于足月产组，差异均有统计学意义(均P<0.01)，见表2。

2.3宫颈阴道分泌物CRH、IL-6、TNF-α预测早产的评价

根据ROC曲线，得出孕24～28周宫颈阴道分泌物中CRH、IL-6、TNF-α预测早产的曲线，CRH的曲线下面积(AUC)为0.533(P=0.529)，IL-6的AUC为0.782(P<0.001)，TNF-α的AUC为0.890(P<0.001)，见图1。提示TNF-α是较为准确的预测指标，IL-6次之；虽然早产组CRH高于足月产组，但是其临床预测精确度还不够。

组别IL-6TNF-αCRH早产组110.82±15.1767.74±10.4836.79±8.34足月产组21.48±12.6522.70±9.0214.46±7.55t45.2308.0623.018P<0.001<0.001<0.001

图1宫颈阴道分泌物中CRH、IL-6、TNF-α预测早产的ROC曲线

Fig.1 ROC curve of CRH, IL-6 and TNF-a in cervicovaginal secretions in predicting preterm labor

2.4两组宫颈阴道分泌物中IL-6、TNF-α浓度与CRH水平的相关性

进一步检测阴道分泌物中炎性因子浓度与CRH表达的关系，对早产组孕中期宫颈阴道分泌物中IL-6、TNF-α的浓度与CRH的水平进行了相关性分析，结果发现早产组IL-6水平与CRH的表达呈显著正相关(R2=0.590，P<0.05)，见图2A；TNF-α的水平与CRH的表达也呈显著正相关(R2=0.223，P<0.05)，见图2B。足月组IL-6的水平与CRH的表达也呈正相关(R2=0.139，P<0.05)，见图2C；但足月组中TNF-α的水平与CRH的表达无相关性(R2=0.000，P>0.05)，见图2D。

注：A为早产组CRH与IL-6水平的相关性分析;B为早产组CRH与TNF-α水平的相关性分析;C为足月组CRH与IL-6水平的相关性分析；D为足月组CRH与TNF-α水平的相关性分析。

图2早产组和足月组孕24～28周宫颈阴道分泌物中CRH水平与IL-6和TNF-α水平的相关性分析

Fig.2 Correlation between CRH and levels of IL-6 and TNF-α in cervicovaginal secretions in preterm group and full term group in 24-28 gestational weeks

3讨论

3.1炎性因子IL-6和TNF-α与早产

早产问题的解决关键在于早预测、早干预。基于感染已被公认是引起早产的主要原因，国内外研究者通过动物模型、人体取样等方法在炎性细胞因子与早产方面做了大量研究。其中，IL-6是目前研究的最多的炎性细胞因子，它主要由单核细胞产生，正常妊娠妇女蜕膜、绒毛膜和羊膜中富含单核细胞。适量的IL-6可以在妊娠过程中起到免疫调节作用，一旦分泌过多，可激活白细胞侵入子宫组织，刺激催产素受体的表达，并通过激活丘脑-垂体-肾上腺轴增加前列腺素的产生，从而启动分娩发生。于是，学者们开始研究用IL-6预测早产的发生。目前此类研究大多集中在血清及羊水样本[6]，但2009年Wei等曾系统性回顾了数十年间关于炎症因子与自发性早产的相关性研究，认为只有宫颈分泌物和羊水中的IL-6水平升高与自发性早产密切相关，尤其是小于32周的极早产，血清中IL-6则不然。近来王雅宁等[7]研究后发现宫颈阴道分泌物中IL-6可预测早产发生，联合检测fFN、CRP等可使早产预测敏感度增加。本研究以无症状的孕中期妇女为研究对象，发现早产组妇女孕24～28周宫颈阴道分泌物中IL-6的水平明显高于足月产组，差异有极显著性(P<0.01)，进一步证实了宫颈阴道分泌物中的IL-6水平与自发性早产密切相关，且IL-6的ROC曲线的AUC为0.782(P<0.001)，因此认为孕中期宫颈分泌物IL-6水平可作为预测早产的可靠指标。

TNF-α是具有多种病理生理效应的细胞因子，主要来源于巨噬细胞和合体滋养细胞。Kumar等在2011年体外实验已经证实羊膜与TNF-α和IL-1β共同孵育时张力明显减弱，弹性降低。本研究显示，早产组孕中期无症状妇女宫颈阴道分泌物中TNF-α水平和IL-6都显著高于足月组，再次说明了自发性早产的分娩动因与炎症反应相关，且TNF-α的ROC曲线的AUC为0.890(P<0.001)，因此，孕中期宫颈分泌物TNF-α水平可作为预测早产的可靠指标。TNF-α诱发早产的可能机制是增强了胎膜中基质金属蛋白酶的分泌，通过增加基质降解，降低胎膜组织的张力弹性，在前列腺素的作用下引起胎膜破裂而早产。

3.2 CRH与早产预测

CRH是含41个氨基酸的多肽，最早发现于下丘脑。后来发现妊娠期胎盘能分泌大量的CRH，而且随着妊娠进展，逐步增加，在分娩启动前血浆CRH呈指数升高。2010年张晓欣等研究后发现CRH是分娩的启动子，早产妊娠妇女母体血浆CRH水平不同，其妊娠结局也不同，早产不可避免的妊娠妇女母体血浆CRH水平明显高于继续妊娠妇女，而早产妊娠妇女经过有效抗早产药物治疗后母体血浆CRH明显回落，提示妊娠期母体血浆CRH水平的高低有可能成为预测早产的有效指标。2012年Gao等研究后发现CRH还可以调节胎盘雌激素、孕激素生成，促进胎膜前列腺素的合成和代谢。目前国外也有较多关于CRH与早产关系的文献报道[8-9]。Jeanne等[10]检测了707例孕22～24周孕妇的静脉血CRH，发现当血CRH水平≥24pg/mL时，早产的发生概率提高1.8倍，认为血CRH水平可作为预测早产的重要指标。不论在早产还是足月产中，CRH很可能都是调控分娩启动的触发因子，都与CRH诱发的炎症反应相关。但是阴道分泌物中是否含有CRH，它与早产时宫颈炎症反应、宫颈软化是否相关，国内外目前尚无研究报道。本研究首次检测孕24～28周阴道分泌物中的CRH，结果发现早产的孕妇宫颈阴道分泌物中CRH水平明显高于足月组，差异有显著性(P<0.05)，提示早产可能与阴道分泌物中CRH升高密切相关。CRH的ROC曲线的AUC面积为0.533(P=0.529)，可能还不能单独作为临床预测早产的指标，但是，CRH的水平可与TNF-α和IL-6水平相结合，可提高早产的预测敏感度。

3.3炎性因子的表达与CRH的相关性

本研究发现炎性因子IL-6、TNF-α与CRH很可能都与早产分娩启动密切相关，但它们之间是否存在着相关性，CRH异常增高是否能上调炎性因子的表达，目前尚不清楚。随着对早产中炎性因子作用的研究愈加深入，国内外学者们发现CRH在许多组织中也可能是一种炎性因子，促使炎症反应发生[11-12]，如在自身免疫性疾病关节炎等局部炎症组织中，CRH表达较多，给予CRH受体拮抗剂可缓解或者阻止炎症反应。You等[13]的研究表明CRH能促进子宫平滑肌细胞炎性因子IL-6、TNF-α等的表达，进而诱导子宫激活蛋白而引起子宫收缩。

由于阴道分泌物是由前庭大腺、子宫颈腺体、子宫内膜的分泌物和阴道黏膜的渗出液、脱落的阴道上皮细胞混合而成，阴道分泌物中的CRH、TNF-α可能是由前庭大腺、子宫颈腺体、子宫内膜细胞等分泌。在分娩启动过程中，子宫平滑肌细胞分泌的CRH能够通过旁分泌的途径促使子宫肌细胞产生包括IL-6、TNF-α在内的炎性因子，促使子宫肌局部发生炎症反应。阴道分泌物中的CRH是否也能促进IL-6、TNF-α的生成，尚无研究报道。本研究发现无论早产组还是足月组孕中期的IL-6水平异常增高均与CRH表达上调密切相关，但早产组中关系更为密切(R2=0.590)；而TNF-α的表达在早产组中与CRH水平呈正相关，但在足月组中则表现为无相关性。CRH可能通过促进这些炎症因子的表达，诱发白细胞迁移，这种调控的结果进一步引起前列腺素合成增多，促进宫颈成熟，胎膜破裂，子宫收缩，在早产分娩启动中发挥着重要的作用。因此认为CRH不仅可以作为早产预测指标之一，CRH受体拮抗剂也是未来早产防治的一个新方向。

综上所述，联合检测孕中期母体宫颈阴道分泌物中IL-6、TNF-α和CRH水平，可能成为更容易被孕妇接受且更有效的早产预测方法，而通过CRH受体拮抗剂来抑制CRH分泌进而抑制炎症反应，也为早产的防治提供了一个新途径。