过敏性紫癜患儿25-羟维生素D的表达及与免疫功能的关系

郑荣浩，刘冬蕾，黄 力，朱松柏，贵 琳，吴晓林

(湖北省妇幼保健院儿童肾脏风湿免疫科，湖北 武汉 430070)

过敏性紫癜(Henoch-Schönlein purpura, HSP)又称亨-舒综合征，是儿童时期最常见的一种以小血管炎为主要病理改变的自身免疫性疾病，常累及皮肤、胃肠道、关节、肾脏等多个系统。如累及肾脏则称之为紫癜性肾炎(Henoch-Schönlein purpura nephritis，HSPN)，严重危害儿童健康。HSP发病机制十分复杂，目前普遍认为HSP患儿存在细胞免疫及体液免疫功能紊乱，主要以IgA介导的体液免疫异常为主[1]，但具体机制至今尚未阐明。维生素D是一类脂溶性维生素，25-羟维生素D[25-hydroxyvitamin D, 25-(OH)D]是人体内最佳的反映维生素D水平的一种存在形式，近年来研究表明，维生素D的生物学作用已经超出以前所认识的，其可通过多种途径调节免疫功能及炎症反应，并在一些自身免疫疾病中起重要的作用[2]。研究表明低水平的维生素D与多发性硬化、类风湿性关节炎及系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的发病风险高度相关，且其活性代谢产物与疾病的发生及发展关系密切[2]。HSP作为一种自身免疫性疾病，而维生素D在其中的表达情况如何国内外目前甚少报道，因此本研究检测HSP患儿的25-(OH)D表达情况并分析其与细胞免疫及体液免疫之间的相关性。

1资料与方法

1.1研究对象与分组

选择2016年10月至2018年1月在湖北省妇幼保健院住院的139例HSP患儿作为HSP组，选择同期在我院门诊体检正常的80例儿童作为健康对照组。139例HSP组患儿根据是否合并肾脏受累又分为非紫癜性肾炎组(NHSPN组)108例和紫癜性肾炎组(HSPN组)31例。纳入标准：HSP的诊断参考2013年中华医学会儿科学分会免疫学组提出的诊断标准[1]。HSPN的纳入标准：首次发作的HSP患儿，在急性期内出现血尿和(或)蛋白尿，并排除乙肝病毒相关性肾炎及狼疮性肾炎等继发性肾小球肾炎，具体诊断标准参考2016年中华医学会儿科学分会肾脏学组提出的诊断标准[3]。排除标准：①既往3个月内使用任何形式的维生素D治疗或补充者；②既往伴有遗传、代谢、免疫缺陷性疾病，慢性肝肾和消化道疾病，以及活动性佝偻病史。

1.2检测方法

1.2.1标本采集

所有HSP组患儿均在使用激素、免疫抑制剂和维生素D治疗前采集静脉血6mL，健康对照组儿童在补充维生素D前空腹采集静脉血6mL，于8小时内进行外周血25-(OH)D、T淋巴细胞亚群(CD3+T、CD4+T及CD8+T)、自然杀伤细胞(NK细胞，即CD16+CD56+)、B细胞(CD19+)水平、IgA、IgG、IgM、IgE、C3及C4的水平等检测。

1.2.2血清25-(OH)D水平的检测

采用液相色谱-串联质谱法检测，仪器为岛津公司的三重四级杆串联质谱仪(型号：岛津8050)。具体步骤为：取血清200μL，加内标溶液(25-羟基维生素D3-氘6和25-羟基维生素D2-氘3)按1∶1比例混合；加10μL甲酸水后常温下10 000r/min离心5min；取上清液200μL,加正乙烷，再次常温下10 000r/min离心10min；分层后取上层，氮气吹干；加复溶液100μL，上机检测。

1.2.3免疫指标的检测

使用美国BD公司FACSCantoⅡ进行流式细胞术检测HSP患儿的T淋巴细胞亚群、NK细胞及B细胞水平，试剂购自碧迪医疗器械(上海)有限公司；采用美国Beckman公司的Immage800进行免疫比浊法检测HSP患儿外周血IgA、IgG、IgM、IgE、C3、C4及C50的水平，试剂为美国Beckman公司的配套试剂；具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行。

1.3伦理审查

本研究经我院医学伦理道德委员会审查并批准，所有入选患儿家属均签署知情同意书。

1.4统计学方法

采用SPSS 25.0软件进行统计分析。正态分布的计量资料以均数±标准差表示；多样本之间均数进行比较，采用方差分析；两组间采取独立样本t检验；计数资料采取卡方检验；使用二元Logistic回归分析25-(OH)D影响HSP患儿发病及并发HSPN的风险，并采用多元线性回归分析血清25-(OH)D与各免疫指标的相关性；以α=0.05为检验水准，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1一般临床资料比较

各组儿童年龄、性别、身高、体重、抽血季节及体质量指数间无明显统计学差异，见表1。

表1 各组儿童一般情况的比较

2.2血清25-(OH)D在各组儿童中的表达情况

HSP组患儿的血清25-(OH)D水平明显低于健康对照组(t=-9.103,P<0.001)，HSPN组患儿血清25-(OH)D水平分别低于NHSPN组和健康对照组，差异均具有统计学意义(t值分别为2.857、-8.955,均P<0.05)，见表2。

组别例数(n)25-(OH)D(ng/mL)健康对照组8042.318±16.980HSP组13923.262±10.400*NHSPN组10824.657±10.062*HSPN组3118.793±10.109*&

注：*与健康对照组相比t值分别为-9.103、-8.955、8.955,均P<0.05；&与NHSPN组相比t=2.857,P=0.005。

2.3各组儿童在不同季节血清25-(OH)D的表达情况

62例3～9月发病的HSP组患儿中有13例并发HSPN，77例9月～次年3月发病的HSP组患儿中有18例并发HSPN。3～<9月发病和9月～次年3月发病的HSP组患儿血清25-(OH)D水平分别低于同时间段健康对照组儿童(t值分别为-8.347、-4.562，均P<0.05)，但9月～次年3月发病的HSPN组患儿血清25-(OH)D水平与同时间段NHSPN组患儿的比较无明显差异(t=1.336，P=0.186)，见表3。

2.4血清25-(OH)D与HSP患儿发病及并发HSPN的风险关系分析

血清25-(OH)D影响HSP患病及并发HSPN的二元Logistic回归分析显示，健康对照组儿童血清25-(OH)D水平每降低1ng/mL，其发生HSP的风险将增加至原来的1.103倍(OR=1.103,95%CI:1.073～1.133,P<0.001)，而HSP组患儿25-(OH)D水平每升高1ng/mL，其发生肾脏受累的风险降低至原来的0.939倍(OR=0.939,95%CI:0.897～0.983,P=0.007)，见表4和表5。

组别3～<9月9月～次年3月健康对照组45.326±13.99938.249±19.831HSP组25.491±10.703*21.954±9.580**NHSPN组27.464±9.940*22.755±9.373**HSPN组18.054±10.552*19.327±10.052**

注：*与同时间段健康对照组相比t值分别为-8.347、-7.129、-2.997,均P<0.05；**与同时间段健康对照组相比t值分别为-4.562、-4.288、4.565,均P<0.05。

表4血清25-(OH)D影响HSP发病的二元Logistic回归分析结果

Table 4 Binary Logistical regression analysis of serum 25-(OH)D influencing the incidence of HSP

表5血清25-(OH)D影响HSP并发肾脏受累的二元Logistic回归分析结果

Table 5 Binary Logistical regression analysis of serum 25-(OH)D influencing HSP with renal involvement

2.5血清25-(OH)D与各免疫指标间的相关性

将HSP组患儿的CD3+T、CD4+T、CD8+T、NK细胞(CD16+CD56+)、B细胞(CD19+)、IgA、IgG、IgM、IgE、C3、C4及CD4+T/CD8+T比值等各因素与25-(OH)D进行多元线性回归分析，因淋巴细胞亚群各组的绝对数量差异较大，故本研究采用淋巴细胞亚群之间的相对百分率来表示其水平，回归模型采用逐步回归法，最后进入回归模型的因素有CD8+T和IgA，HSP患儿血清25-(OH)D水平与IgA及CD8+T水平呈负相关(β=-0.418，t=-5.538，P<0.001；β=-0.231，t=-3.064，P=0.003)，见表6。

表6 血清25-(OH)D与各免疫指标之间的多元线性回归分析结果

3讨论

3.1 25-(OH)D的水平在HSP患儿中的变化

维生素D是一类脂溶性维生素，经紫外线照射皮肤合成和食物摄取的维生素D先经过肝脏转化为25-(OH)D，再经过肾脏转化为1,25-二羟维生素D[1,25-Hydroxyvitamin D，1,25-(OH)2D]，最后通过作用于细胞的维生素D受体(Vitamin D receptors,VDR)发挥生物学效应。25-(OH)D及1,25-(OH)2D均为维生素D在血液中的存在形式，但因为25-(OH)D半衰期长，在血液中浓度稳定，故25-(OH)D是反映体内维生素D水平的最佳指标。研究表明维生素D的水平在类风湿性关节炎及系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病中明显降低，且可能在免疫性疾病发病机制中起重要作用[2]。本研究显示，HSP患儿血清25-(OH)D水平明显低于健康对照组，HSPN组患儿血清25-(OH)D水平低于NHSPN组和健康对照组，这与郭桂梅等[4]及张远达等[5]研究结果一致，虽然他们测定的不是25-(OH)D水平，但都是维生素D的不同代谢产物，这提示维生素D可能参了HSP的发病过程，并可能与其肾脏受累有一定关系。

3.2 25-(OH)D与免疫功能的关系

T细胞功能改变，B细胞多克隆活化，体液免疫反应总体处于亢进状态，特别是以IgA介导的体液免疫异常等在HSP发病中起重要作用[1]。本研究显示HSP患儿血清25-(OH)D水平与CD8+T及IgA水平呈负相关，表明25-(OH)D可能参与了HSP的免疫发病机制，与细胞免疫及体液免疫均有关。研究表明维生素D除参与钙磷代谢外，可通过多种途径调节人体的免疫功能。Lysandropoulos等[6]的研究表明1,25-(OH)2D可以下调CD8+T细胞水平并抑制其产生细胞因子γ-干扰素和肿瘤坏死因子-α，而且VDR基因敲除的老鼠体内也显示升高的CD8+T细胞水平，这可以解释本研究HSP患儿的25-(OH)D与CD8+T呈负相关的关系。滤泡辅助性T细胞(follicular helper T cells, Tfh细胞)是近年来被命名的一类新的CD4+T细胞亚群，主要负责辅助B细胞激活、增生及分化而影响免疫球蛋白的产生[7]。邹敏书等[8]的研究显示HSP患者体内存在高表达的Tfh细胞，且维生素D可以通过降低Tfh细胞水平来改善HSP体内的免疫反应。1,25-(OH)2D也可多方面影响B细胞，抑制其增殖、免疫球蛋白类型转化及抗体的生成[2]。本研究显示HSP患儿血清25-(OH)D水平降低，且与IgA水平呈负相关，因此我们推测患儿体内低水平的维生素D也许不能通过降低Tfh细胞而完全作用于B细胞来抑制免疫球蛋白的产生，导致HSP体内高水平的IgA状态，从而进一步造成大量IgA沉积于肾脏引起肾脏受累，这也可以解释本研究HSPN组的25-(OH)D水平更低的原因。体内及体外实验均显示，维生素D活性的降低与IgE的升高相关[9]，维生素D也可通过抑制核因子-κB的信号通路途径来抑制IgE的抗体类别转换[10]，鉴于哮喘和一些过敏性疾病中也存在维生素D缺乏，因此有学者认为维生素D缺乏与哮喘和一些过敏性疾病的高IgE水平有关[2]。但本研究未发现25-(OH)D与IgE之间存在明显的相关性，一方面可能是HSP作为一种自身免疫性疾病，过敏因素并不是HSP的主要病因，另一方面可能因为维生素D在不同疾病中对免疫反应的影响不一致有关。1,25-(OH)2D也可影响辅助性T细胞1(helper T cell 1,Th1)、Th2、调节性T细胞以及Th17细胞等CD4+T细胞亚群，但目前主要聚集在多发性硬化、类风湿性关节炎及系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的研究中[2]。

3.3 25-(OH)D与HSP患儿发病及并发HSPN的风险关系

本研究显示25-(OH)D为影响HSP发病及并发HSPN的危险因素，健康儿童血清25-(OH)D水平每降低1ng/mL，其发生HSP的风险将增加至原来的1.103倍，而HSP患儿25-(OH)D水平每升高1ng/mL，其发生肾脏受累的风险降低至原来的0.939倍。一些临床研究初步表明，补充维生素D可能降低类风湿性关节炎的复发及减少系统性红斑狼疮患者抗双链DNA的阳性率[11]，邹敏书等[8]的研究表明维生素D治疗可以改善HSP患儿的免疫功能，因此HSP患儿尤其是并发肾脏受累者的治疗有必要进行维生素D的治疗或补充。目前，维生素D水平低下的参考值是整个健康人群维持正常骨骼代谢所需的最小值，然而对于可以维持免疫调节作用的维生素D的水平尚不明确，有研究认为对于风湿免疫性疾病应给予高于健康儿童维生素D推荐剂量的2～3倍[12]，但具体剂量及疗效尚需进一步的研究。

总之，维生素D在自身免疫性疾病中的作用已成为一个研究热点。本研究表明，维生素D在HSP中水平降低且与细胞免疫及体液免疫均相关，因此，维生素D的水平改变及其作用与HSP的关系具有极其重要的研究价值。