γ-聚谷氨酸固态发酵提取液的脱色研究

◎ 欧诗亮，王永东，邹水洋

（东莞理工学院应用化学系，广东 东莞 523808）

γ-聚谷氨酸（γ-poly glutamic acid，γ-PGA）作为一种新型的可生物降解高分子材料，因其强吸水性、免疫原性、高成膜性和生物组织相容等良好性能[1]，具有广阔的应用前景。

γ-PGA常用的生产方法是微生物发酵法。成品γ-PGA是白色晶体或粉末状，而发酵液会带有一定的颜色，因此在醇析提取之前必须通过各种手段去除色素。色素的来源既有原料本身，也有杀菌和发酵过程中产生的。由于培养基中含有大量谷氨酸、多肽以及蛋白质，很容易与还原糖发生美拉德反应产生褐变[2]；基于γ-PGA发酵液中菌体含量高，黏度大，色素成分复杂使得脱色较为困难且产物损失大。所以脱色工艺是γ-PGA生产中必须高度重视的关键环节。目前脱色主要采用大孔吸附型树脂、离子交换树脂、活性炭粉、活性炭颗粒、硅藻土等吸附剂，然而这些物质脱色吸附的同时也降低了产物的含量[3]。因此，本文拟考察多种吸附剂及其脱色工艺条件对产品脱色率和回收率的影响以获取优化的脱色工艺。

1 材料与方法

1.1 材料

豆芽汁：大豆芽（市售）0.5 kg，加水2.5 kg，煮沸，浓缩至1 000 mL，过滤待用；种子液培养基：100 mL豆芽汁，5 g蔗糖，pH自然；大豆水解液：50 g干黄豆打碎成粉末，以1∶10的比例加入500 mL蒸馏水，加热煮沸过滤得大豆浆液，降至室温加入5 g碱性蛋白酶，调节pH 9.5、60 ℃水浴搅拌2 h，再加热煮沸2 min灭活酶；固体发酵培养基：将大豆水解液（加入葡萄糖1%和5%的谷氨酸钠，调pH7.0）与麸皮按照1∶1的比例搅拌均匀，250 mL锥形瓶装料量20 g，110 ℃灭菌20 min。活性炭，东莞洪笙活性炭有限公司；活性白土，乐平市洁净漂白土有限公司；凹凸棒黏土（江苏奥特邦非金属矿业有限公司）；谷氨酸钠（≥99%），广州奥桑味精食品有限公司；γ-PGA（化妆品级），山东福瑞达生物科技有限公司；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），中国工业微生物菌种保藏中心（CICC20645）；碱性蛋白酶（200 000 U/g）：江苏锐阳生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 实验仪器

YM-50 立式压力蒸汽灭菌锅：上海三中医疗器械有限公司；UV-1100紫外可见分光光度计：上海美普达仪器有限公司；HQL300B 柜式恒温冷冻摇床：武汉中科科仪技术发展公司；BCD-256KFA 冰箱：青岛海尔股份有限公司；TDL-5-A多管离心机：上海安亭科学仪器厂；SW-CJ-1F净化工作台：苏州安泰空气技术有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 γ-PGA发酵提取液的制备

取斜面种子接种于种子液培养基，37 ℃、120 r/min恒温培养24 h即为种子液。将种子液按8%接种量接种于固体发酵培养基，37 ℃恒温静置培养48 h。加10倍重量的蒸馏水于固体发酵物中，28 ℃搅拌（200 r/min）1 h，然后用2层纱布过滤，滤液5 000 r/min离心20 min，取上清液（发酵提取液）待用。

1.3.2 γ-PGA发酵提取液的脱色

250 mL烧杯中加入100 mL发酵提取液，调节pH，加入一定量的活性炭（或其他吸附剂）搅拌混匀，水浴保温一定时间，然后离心分离（5 000 r/min，20 min），取上清液测660 nm处吸光度和γ-PGA的浓度。

1.3.3 活性炭脱色正交实验设计

由于活性炭是最常用的脱色吸附剂，因此先用正交实验优化其脱色工艺。通过预实验初步确定了其影响因素及作用范围为：温度40～60 ℃、时间0.5～2 h、pH 4～6、加活性炭量20～30 g/L，选择L9（34）正交表设计正交试验。正交试验因素及水平见表1。

表1 活性炭脱色正交实验设计表

1.3.4 活性炭不同预处理方法对γ-PGA脱色效果的影响

活性炭按30 g/L的标准用量，分别采用以下不同预处理方法：①加入1 mol/L盐酸100 mL，60 ℃水浴3 min，离心去上清液，用蒸馏水多次洗涤至中性，烘干。②热水煮沸30 min，离心去上清液，烘干。③不进行预处理的活性炭作为对照。将以上3种活性炭分别对发酵液进行脱色实验。

1.3.5 微晶纤维素与活性炭协同对γ-PGA脱色效果的影响

在100 mL发酵提取液中先加入3.0 g活性炭，再分别加入0～7.5 g微晶纤维素，对照组仅加入3.0 g微晶纤维素，搅拌混匀后于水浴60 ℃保温1 h，5000 r/min离心20 min，取上清液分别测定吸光度和γ-PGA的浓度。

1.3.6 不同吸附剂合用对γ-PGA脱色效果的比较

在正交试验优化发酵提取液纯化工艺的条件下，进一步探讨活性炭与其他吸附剂联合使用对脱色效果和γ-PGA回收率的影响。单一吸附剂脱色实验中各种吸附剂用量均为30 g/L，两种吸附剂混合脱色或先后脱色实验中各种吸附剂用量均为15 g/L。

1.4 测试方法

（1）γ-PGA含量的测定。用CTAB比浊法测定γ-PGA的含量[4]。

（2）γ-PGA发酵提取液色度的测定。将脱色前后的γ-PGA发酵提取液用蒸馏水稀释10倍，以蒸馏水作参比调零，在660 nm波长下，使用紫外分光光度计分别测定脱色前后的发酵提取液的吸光度，计算得每种脱色方案的脱色率。计算公式：

2 结果与讨论

2.1 正交试验的优化结果分析

根据单因素试验确定的温度、pH、保温时间及活性炭添加量，利用L9（34）正交表建立的正交试验方案及实验结果见表2。

表2 L9（34）正交表建立的正交试验方案及实验结果分析表

对表2中的脱色率进行统计分析，通过R值分析可知，对脱色效果的影响因素显著性排序为脱色时间＞活性炭用量＞pH＞脱色温度。对K值的分析比较可知优化的脱色工艺条件是A2B2C3D3，即为温度50 ℃、pH 5、时间2 h、活性炭用量30 g/L；同时，优化工艺条件后的实验操作结果也验证了正交实验设计理论的正确性，其脱色率较高，为83.37%。因此，发酵液脱色的最优工艺为活性炭添加量30 g/L、脱色时间2 h、pH为5、温度50 ℃。

2.2 不同预处理的活性炭的影响

如表3所示，盐酸预处理的活性炭脱色效果显著，高达92.14%，但对γ-PGA的回收率很低，只有11.78%。经盐酸预处理的活性炭脱色效果提高的原因可能是盐酸溶解了活性炭中大量的无机成分，增加了内部孔隙率，并使活性炭上的一些活性基团得以自由，从而增强其吸附性能。但活性炭较大的孔隙会增加其对大分子的吸附，导致γ-PGA损失严重。开水煮沸的和不进行预处理的活性炭无论从脱色率和γ-PGA的回收率来看，效果相差无几，虽然其脱色效果低于盐酸处理后的活性炭，但γ-PGA的损失相对较小，为减少工艺环节，后续实验仍以不经任何预处理的活性炭进行脱色实验。

表3 活性炭不同的预处理方式对脱色效果的影响表

2.3 微晶纤维素添加量的影响

微晶纤维素是天然纤维素经稀酸水解至极限聚合度的可自由流动的极细微的短棒状或粉末状、多孔状颗粒，可用作吸附剂。为提高γ-PGA发酵提取液的脱色效果，尝试用微晶纤维素和活性炭混合使用作为脱色剂，实验结果如图1所示。微晶纤维素和活性炭混合使用较单独使用活性炭或微晶纤维素能一定程度提高脱色效果，其中微晶纤维素添加量为35 g/L时表现最佳，脱色率达87.90%，γ-PGA回收率达44.41%。但总的来看，微晶纤维素增效作用不大，产物回收率不高，过多微晶纤维素的加入使产物回收率显著降低。

图1 微晶纤维素的添加量对活性炭脱色的影响图

2.4 不同吸附剂合用脱色效果的比较

活性白土、凹凸棒黏土是常用的无机吸附剂和絮凝剂，在研究中发现，活性白土、凹凸棒黏土对发酵提取液的色素吸附有一定效果，尤其能降低发酵液浊度（具有澄清溶液的作用）。因此尝试将活性白土、凹凸棒黏土与活性炭联合使用来考察它们对γ-PGA发酵提取液的脱色效果，实验结果如表4所示。

表4 不同吸附剂及作用方式的脱色效果及产物回收率表

由表4可知，不同吸附剂及作用方式对发酵提取液的脱色效果和γ-PGA的回收效果有显著影响。单独使用活性白土或凹凸棒黏土脱色效果不及活性炭。将活性炭分别与活性白土或凹凸棒黏土减半后混合使用，脱色率及回收率均比单独使用有所提高，但效果还不够理想；活性炭与活性白土混合使用能使脱色率达到92.12%，效果很好，但γ-PGA回收率仍处于较低水平，只有60.87%。如将活性炭分别与活性白土或凹凸棒黏土按先后次序联用，脱色率分别为90.76%、92.53%，γ-PGA回收率分别为82.40%、88.20%，较混合使用的处理效果明显提高，且达到较理想的水平。

不同吸附剂对色素物质的选择吸附能力各不相同，虽然活性炭对发酵提取液的脱色效果较好，但对γ-PGA的吸附作用也很强，活性炭用量过大容易造成γ-PGA的损失。而活性白土和凹凸棒黏土的脱色效果虽然比活性炭低，但对色素物质的选择性吸附使之与活性炭形成一定程度的互补作用，因而与活性炭联合使用（混合或串联）能有效提高脱色率。贺杨扬等[5]人的研究指出，硅藻土吸附剂形成的滤饼层有利于γ-PGA发酵液中菌体截留和杂蛋白吸附。活性白土和凹凸棒黏土也有类似助滤作用，这是其降低发酵液浊度的重要原因。另外，发酵液的浊度和吸附剂用量对吸附过程影响复杂，过高的发酵液浊度及吸附剂用量会降低吸附剂的选择性，γ-PGA发酵液中如存在较多的吸附剂（单独或混合）会导致γ-PGA的较大损失。因此，本实验将活性炭分别与活性白土、凹凸棒黏土在较低用量下按先后次序串联使用的方法既利用了不同吸附剂之间的互补性，又避免了过高浓度的吸附剂对目标产物的无选择吸附，使脱色率和产物回收率均达到了较理想水平，具有潜在的实用价值。

3 结论

通过正交试验优化γ-PGA发酵提取液脱色工艺条件如下：温度50 ℃、pH为5、时间2 h、活性炭添加量为30 g/L时，γ-PGA发酵液的脱色效果最好，脱色率达83.37%。将15 g/L活性炭分别与15 g/L活性白土、凹凸棒黏土按先后次序对γ-PGA发酵提取液进行脱色处理能达到良好的脱色效果和较高的产物回收率，其中活性炭与凹凸棒黏联用的脱色率和产物回收率分别达到92.53%、88.20%。该方法既利用了不同吸附剂之间的互补性，又避免了吸附剂的过高浓度对目标产物的无选择吸附，为γ-PGA发酵提取液的脱色工艺提供了新的思路。