碳青霉烯类耐药弗劳地枸橼酸杆菌中质粒介导blaNDM-1基因的研究

杜 娜 ， 林 云 ， 刘淑敏 ， 牛 敏 ， 李亚波 ， 施雄飞 ， 周 芳 ， 尧 静 ， 张孟爽 ，杜 艳

弗劳地枸橼酸杆菌属肠杆菌科细菌，是重要的医院感染病原菌，可引起腹泻、脑膜炎、尿路感染、呼吸道感染和血流感染[1]。临床分离的弗劳地枸橼酸杆菌对碳青霉烯类耐药最主要的机制是产碳青霉烯酶，主要包括KPC、VIM、IMP、OXA-48和NDM-1酶[2]。部分产NDM-1酶细菌会对除氨曲南外的几乎所有抗菌药物耐药，仅剩替加环素和多黏菌素可用。已有报道表明质粒是介导blaNDM-1基因水平转移的重要移动元件，但是这些发现大多集中在肺炎克雷伯菌[3]、大肠埃细菌[4]和鲍曼不动杆菌[5]，弗劳地枸橼酸杆菌研究相对较少。本研究拟通过对18株产NDM-1酶弗劳地枸橼酸杆菌进行接合试验、脉冲场凝胶电泳（PFGE）试验及Southern印迹杂交试验，明确blaNDM-1基因的水平转移机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 收集昆明医科大学第一附属医院2012年6月－2014年10月产NDM-1酶弗劳地枸橼酸杆菌18株，经改良Hodge试验、金属酶（MBL）表型确证试验以及聚合酶链反应（PCR）法检测NDM-1酶及基因，通过 VITEK 2 进行菌株鉴定。菌株来源于尿液标本。包括移植中心12株，干疗科3株，泌尿外科、神经外科、中医科各1株。沙门菌 H9812 菌株由俞云松教授惠赠，质控菌大肠埃希菌ATCC 25922由本科室保存。

1.1.2 试剂 MH肉汤/琼脂干粉购自英国OXOID公司，亚胺培南购自合肥博美生物科技有限公司，利福平购自北京酷来博科技有限公司，PCR所用试剂、大量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、5×TBE等购于天根（北京）科技有限公司，AgaroseⅢ胶购于美国Bio-Rad公司，蛋白酶K和Brij58购于美国Sigma公司，S1核酸内切酶购于美国Promega公司，尼龙膜购于美国Millipore公司，Southern印迹杂交试剂盒DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I购于美国Roche公司，枸橼酸钠、Tris、氯化钠和低熔点胶等试剂购自上海生工生物工程有限公司。

1.1.3 仪器 VITEK 2全自动微生物鉴定与药敏分析仪购自法国生物梅里埃公司，培养箱购自昆明友宁科技公司，1G603二级生物安全柜购自美国Baker公司，MyCycler TM thermalCycler DNA扩增仪、Power Pac3000型电泳仪、CHEF Mapper XA PFGE系统、化学发光凝胶成像系统均购自美国Bio-Rad公司，紫外分光光度计购自美国Thermo公司，分子杂交箱购自美国SHELLAB公司，水浴箱购自上海精宏实验设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌鉴定及药敏试验 采用VITEK 2系统进行菌种鉴定及药敏试验。药敏结果的判读参照2014 年 CLSI M100-S24 标准。

1.2.2 接合试验 供体菌为前期研究基础上分离的产NDM-1酶弗劳地枸橼酸杆菌，受体菌为利福平耐药的大肠埃希菌EC600。将供受体菌转种于MH平皿上，37 ℃过夜培养后挑取单个菌落接种于MH肉汤，37 ℃过夜培养，将供、受体菌按1∶1比例加入MH肉汤混合静置培养，37 ℃过夜。将混合菌液和供、受体菌纯菌液均接种在含4 mg/L 亚胺培南和256 mg/L利福平的MH平皿上，供受体纯菌液不生长而混合菌液生长为接合子，再采用VITEK 2 两对接合子进行菌种鉴定，菌种为大肠埃希菌者为接合子，最后再通过PCR验证，扩增NDM-1基因阳性者为接合子。

1.2.3 PFGE分离质粒 取在MH平皿上纯培养后的细菌调配菌液，紫外分光光度计测得的590 nm处吸光度值0.8～1.0为宜，将菌液与2%低熔点胶以1∶1比例进行细菌包埋。细菌包埋后用S1核酸酶在50 μL体系[ ddH2O 44.5 μL，10×buffer 5 μL，S1核酸酶（80 U/μL）0.5 μL ] 进行酶切，37 ℃水浴箱中孵育2 h后进行PFGE。电泳条件：6 V/cm，脉冲时间2.16～63.8 s，14 ℃，0.5×TBE缓冲液，电场角度120°，总时间为18 h。S1核酸酶可将染色体DNA降解而质粒DNA则消化成线性DNA，因而在PFGE图谱中只能看见质粒DNA条带，通过与Marker进行比对，读取质粒的大小。

1.2.4 Southern印迹杂交试验 ①探针的制备：选取1株经PCR确证为blaNDM-l基因阳性的菌株扩增。引物为F：5'-GGGCAGTCGCTTCCAACGGT-3'，R：5'-GATGTGCTCAGTGTCGGCAT-3'。扩增条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s，63 ℃30 s，72 ℃ 45 s，35个循环；最后72 ℃延伸3 min。反应体系为：总体积25 μL，DNA模板1 μL，2×TaqPCR Master MIX 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上、下游引物各1 μL。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定blaNDM-1基因片段。使用大量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对扩增产物进行切胶纯化。使用DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I试剂盒中的DIG-High Prime进行DNA地高辛标记；②Southern印迹杂交：将PFGE胶上的DNA转移至尼龙膜上，按照Southern印迹杂交试剂盒DIGHigh Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I进行操作。

2 结果

2.1 药敏结果

18株细菌对青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类抗生素的耐药率高达 100%，对氨曲南、庆大霉素、甲氧苄啶-磺胺甲唑、环丙沙星、四环素、左氧氟沙星和呋喃妥因耐药率分别为 66.7%（12株）、66.7%（12株）、66.7%（12株）、61.1%（11株）、61.1%（11株）、33.3%（6株）和 11.1%（2株）。接合子均对碳青霉烯类抗生素耐药。

2.2 PFGE分离质粒

质粒条带在PFGE图上清晰可见，18株菌携带质粒的大小为33.3～310.1 kb，数目为1～5个。见图1。

图1 18株产NDM-1酶弗劳地枸橼酸杆菌经S1核酸酶酶切后的脉冲场凝胶电泳图Figure 1 Pulsed-field gel electrophoresis patterns of S1-digested DNA of 18 Citrobacter freundii isolates

2.3 Southern印迹杂交

18株菌中有2株菌（15、16列）的blaNDM-1基因定位在33.3～54.7 kb大小的质粒上，其余菌株的blaNDM-1基因均位于约33.3 kb大小的质粒上。见图 2。

3 讨论

图2 质粒与NDM-1探针的Southern印迹杂交图Figure 2 Results of Southern blot hybridization between plasmid and NDM-1 probe

弗劳地枸橼酸杆菌常寄生于人和动物肠道，广泛分布于自然界及医院环境中，是条件致病菌，可引起腹泻、脑膜炎、尿路感染、呼吸道感染和血流感染。据中国医院内病原菌耐药性监测网（NPRS） 显示近年来在分离的肠杆菌科细菌中，枸橼酸杆菌属占较大比例。随着碳青霉烯类抗生素的大量使用，临床分离的耐碳青霉烯类弗劳地枸橼酸杆菌不断增加。NDM-1酶是2008年由Yong等[6]在1例感染肺炎克雷伯菌的印度裔瑞典患者的尿液标本中首次发现，此后在世界范围内屡见报道。NDM-1酶常在肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌及阴沟肠杆菌中检出，在弗劳地枸橼酸杆菌中少见报道。2016年林迪等[7]报道了4株产NDM-1酶弗劳地枸橼酸杆菌，但是并未对blaNDM-1基因进行定位分析。本研究对18株产NDM-1酶弗劳地枸橼酸杆菌blaNDM-1基因定位于质粒进行了系统分析。

本研究药敏结果显示产NDM-1酶弗劳地枸橼酸杆菌以多重耐药为显著特点，除对碳青霉烯类、头孢菌素类、青霉素类、氟喹诺酮类和氨基糖苷类抗菌药物耐药外，部分菌株还对氨曲南耐药，而金属β内酰胺酶不能水解氨曲南[8]，因此推测部分菌株中还存在其他β内酰胺酶介导对氨曲南的耐药。接合试验表明18株菌中有13株接合成功，blaNDM-1基因成功地从弗劳地枸橼酸杆菌中转移至大肠埃希菌，并呈现出碳青霉烯类抗生素耐药表型，这初步表明blaNDM-1基因是位于接合质粒上，能通过质粒进行水平转移。

碳青霉烯类耐药基因常位于一些移动元件如质粒、整合子和插入序列共同区（ISCR）上，在同种属或不同种属细菌间穿梭，导致多重耐药菌株的产生，给临床抗感染治疗带来了极大困难。本组在前期研究中对产NDM-1酶弗劳地枸橼酸杆菌进行了克隆传播研究及整合子和ISCR 1元件的检测，结果表明产NDM-1酶弗劳地枸橼酸杆菌克隆传播趋势不明显，且blaNDM-1基因的传播与整合子和ISCR1元件无关，但是在这两种移动元件中检出了氨基糖苷类和磺胺类抗菌药物耐药基因[9]。本研究继续对质粒进行深入研究，在PFGE图谱上可以清晰地看到每株菌中含有的质粒数目及大小都不一样，但是有16株菌均含有一个约33.3 kb大小的质粒，通过Southern印迹杂交进行定位分析发现这16株菌的blaNDM-1基因均位于该质粒上，另外2株菌的blaNDM-1基因也位于质粒上，大小为33.3～54.7 kb。国内已有多个地区包括北京、上海、香港、山东、河南及云南等报道了blaNDM-1基因位于质粒上，质粒的大小为50～360 kb[10-11]，质粒的大小与我们的报道不一致。

“NDM-1超级细菌”已在世界范围内播散，遏制此种细菌的传播不仅需要多地区的合作，更需要医院感染控制部门、微生物检验部门及临床相关科室间的相互协作。本研究证明了耐碳青霉烯类弗劳地枸橼酸杆菌中的blaNDM-1基因是通过质粒进行水平传播的，期望能为临床抗感染治疗及遏制产NDM-1酶细菌的传播提供理论依据。