泸州地区医院环境中产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌耐药基因研究

孙 瑞，何 丹，郝 雯，孙 秀，廖婉琳，周英顺

(西南医科大学基础医学院病原生物学教研室，四川泸州 646000)

细菌对抗菌药物的耐药问题日益严重，其耐药水平及程度越来越高，已经成为全球关注的公共卫生问题[1-2]。产抗生素水解酶是导致细菌耐药的主要原因[3]。而β-内酰胺酶是细菌产生的可水解青霉素类及头孢类等多种抗生素的蛋白，尤其是产超光谱β-内酰胺酶（extended spectyum-β-lactamase，ESBLs）的细菌给临床感染的诊治造成严重挑战[4]。中国细菌耐药监测网数据显示，产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌仍然是临床分离最高菌株（http://www.carss.cn/），产β-内酰胺酶大肠杆菌严重威胁到临床感染的诊[5]。研究发现，医院环境（污水、洗手间、门把手、医疗废弃物）中耐药菌可加速耐药菌院内感染，同时也促进了耐药菌的播散，加重了临床感染治疗的负担[6-7]。因此开展医院环境大肠杆菌及耐药性的监测及监控，对院内感染的防治具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试剂及标准菌株

胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）、胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）、麦康凯琼脂，LB固体培养基、LB营养琼脂、M-H肉汤培养基等购自北京索莱宝科技有限公司；DNA 聚合酶 Ex Taq、Premix TaqTM、dNTP Mixture、DNA Marker、均购自TakaRa大连宝生物有限公司；琼脂糖、核酸染料购自英潍捷基；引物合成及测序由上海生工技术有限公司完成。药敏纸片购自温州康泰生物技术有限公司。大肠杆菌标准菌株ATCC25922由西南医科大学病原生物学教研室保存。

1.2 标本采集及细菌分离鉴定

无菌棉签采集四川省泸州地区六家医院的环境样品包括病房地板、电梯按钮、卫生间水龙头、病房门把手、换药室、垃圾桶、空气等标本200份，均匀涂抹在麦康凯琼脂平板，37℃过夜培养后，挑红色单菌落于液体TSB培养基震荡培养12 h，使用16s RNA通用引物27F和1429R PCR扩增16s RNA基因，电泳检测PCR产物，并将PCR产物送上海生工有限责任公司进行序列测定。所获序列通过GenBank、Ez-Taxon6和LeBIBI数据库鉴定菌种种属关系。

1.3 药敏表型测定

对通过16s RNA序列测定比对确定为大肠杆菌菌株进行ESBLs确证实验，方法参照美国临床实验室委员会（CLSI-M100-S17）标准进行。对ESBLs为阳性的菌株进行氯霉素、四环素、环丙沙星、诺氟沙星、头孢噻呋、氨苄西林、磺胺甲氧嘧啶、阿米卡星等抗生素药敏实验。按照美国临床实验室委员会标（CLSI）推荐的K-B纸片法进行。将所分离大肠杆菌培养至对数生长期，生理盐水稀释到OD值为0.08～0.1之间，使用灭菌棉拭子蘸取菌液均匀涂布于TSA培养基,将所选择的药敏纸片等距地贴在琼脂平板表面。37℃过夜培养，游标卡尺测量抑菌圈大小并按照标准进行结果判定。大肠杆菌ATCC25922作为阴性对照。

1.4 细菌耐药基因检测

挑ESBLs阳性菌株单菌落于TSB肉汤培养基震荡过夜培养。参考分子克隆手册采用煮沸法制备DNA模板。使用PCR方法扩增磺胺类耐药基因（sul1，sul2，sul3），氯霉素耐药基因（cat，floR,cmlA,cfr），氟喹诺酮（qnrA,qnrB,qnrC,qnrD）类，氨基糖苷类耐药基因[（rmtA,rmtB,rmtC,rmtD,aac(6')-Ib,ant(3')-Ia）]，主要的ESBLs基因（blaCTX-M-1,blaCTX-M-2,blaC-TX-M-9,blaSHV,blaTEM），四环素耐药基因（tetA,tetB,tetC），头孢菌素耐药基因（blaCMY和blaDHA）及主要整合子类型（Int1与Int2）进行检测，并对其进行序列测定。引物（表1）由上海生工合成，所获产物送上海生工进行序列测定[8]。

表1 所扩增耐药基因引物序列

b l a CTX-M-1[1 2]b l a CTX-M-2[1 2]b l a CTX-M-9[1 2]b l a SHV [1 2]b l a TEM [1 2]b l a CMY [1 3]b l a DHA [1 3]R m t A [1 4]R m t B [1 4]R m t C [1 4]a a c(6')-I b [1 5]a n t(3')-I a [1 5]t e t A [1 5]t e t B [1 6]t e t C [1 5]I n t 1[1 7]I n t 2[1 7]I n 1[1 7]I n 2 F:G G T T A A A A A A T C A C T G C G T C R:T T G G T G A C G A T T T T A G C C G C F:A T G A T G A C T C A G A G C A T T C G R:T G G G T T A C G A T T T T C G C C G C F:A T G G T G A C A A A G A G A G T G C A R:C C C T T C G G C G A T G A T T C T C F:A T T T G T C G C T T C T T T A C T C G C R:T T T A T G G C G T T A C C T T T G A C C F:A T G A G T A T T C A A C A T T T C C G T G R:T T A C C A A T G C T T A A T C A G T G A G F:T G G C C A G A A C T G A C A G G C A A A R:T T T C T C C T G A A C G T G G C T G G C F:A A C T T T C A C A G G T G T G C T G G G T R:C C G T A C G C A T A C T G G C T T T G C F:C C C G T G A G A T T G T T G C T G R:T G T C T G G T C T T G C G T T T C F:T T T C T G C G G G C G A T G T A A R:A G T T C T G T T C C G A T G G T C T T T F:G A A G A A G T A A C A G C C A A A G R:A T G C C A G C C T C C G T A A A F:A T G A C C T T G C G A T G C T C T A T G R:C G A A T G C C T G G C G T G T T T F:A T C T G G C T A T C T T G C T G A C A R:T A T G A C G G G C T G A T A C T G G F:G G C A C C G A A T G C G T A T G A T R:A A G C G A G C G G G T T G A G A G F:T T G G T T A G G G G C A A G T T T T G R:G T A A T G G G C C A A T A A C A C C G F:C T G G G C T G C T T C C T A A T G C R:A G C T G T C C C T G A T G G T C G T F:T C T C G G G T A A C A T C A A G G 2 4 3 R:G T T C T T C T A C G G C A A G G T F:C A C G G A T A T G C G A C A A A A A G G T 2 3 3 R:G T A G C A A A C G A G T G A C G A A A T G F:A A G C A G A C T T G A C C T G A R:G G C A T C C A A G C A A G F:C G G G A T C C C G G A C G G C A T G C A C G A T T T G T A R:G A T G C C A T C G C A A G T A C G A G[1 7]

2 结果

2.1 菌株分离鉴定及药敏结果

从泸州地区6家医院所采取的200份标本中，分离到大肠杆菌51株，通过药敏表型和ESBLs确证实验，其中24株为ESBLs阳性菌株。24株菌对氯霉素、四环素和磺胺类耐药率为100%，对氟喹诺酮类耐药率为87.5%，对氨基糖苷类耐药率为54.1%。

2.2 药敏试验结果及超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠杆菌耐药基因检测

耐药基因详细结果见表2，发现这24株ESBLs阳性菌，其中blaCTX-M阳性率为19/24（图1），对其序列测定分析发现其中blaCTX-M-14阳性率为6/24，blaC-TX-M-15阳性率为5/24，blaCTX-M-27阳性率为3/24，blaCTX-M-3阳性率为4/24，blaCTX-M-24阳性率为1/24，blaSHV阳性率为17/24，其中 blaSHV-11阳性率为 3/24，blaSHV-12阳性率为7/24，blaSHV-38阳性率为2/24，blaSHV-2a阳性率为3/24，blaSHV-28阳性率为 1/24，blaSHV-26阳性率为 1/24。blaTEM-1阳性率为7/24，头孢菌素耐药基因blaDHA与blaCMY阳性率分别为3/24和1/24。磺胺类耐药基因（sul1与sul2）阳性率分别为11/24和3/24，四环素耐药基因（tetA与tetB）阳性率分别为10/24与1/24。氯霉素耐药基因（floR，cmlA）阳性率分别为5/24与3/24。氟喹诺酮类耐药基因（qnrB，qnrS）阳性率为9/24，2/24。氨基糖苷类耐药基因（rmtA，rmtB，aac(6')-Ib,ant(3')-Ia）阳性率分别为1/24、2/24、6/24、1/24。详细结果见表2，本研究中检测出1型整合子10个，其中有一个菌同时携带I型和II型整合子。其中dfrA17-aadA5和dfrA12-orfF-aadA2结构基因盒菌株均为4株，含有dfrA1-orfC，dfrA1-sat2-aadA1和dfrA17基因盒菌株。

图1 19个blaCTX-M耐药基因电泳图

3 讨 论

多重耐药大肠杆菌分离率依然高居不下,给临床细菌性疾病感染的诊治造成严重挑战（http://www.carss.cn/）[18]。研究表明，医院环境（空气、污水、门把手等）中存在着大量的耐药菌，也可导致院内感染，促进了耐药基因的播散，给耐药的防治带来严重挑战。本研究从泸州地区6家医院环境中分离到51株大肠杆菌，其中ESBLs阳性菌为24株，其对氯霉素、四环素和磺胺类耐药率为100%，对氟喹诺酮类耐药率为87.5%，对氨基糖苷类耐药率为54.1%。表明医院环境中ESBLs大肠杆菌阳性率较高，且对其他抗生素耐药率较高，说明需要加强对医院环境中细菌耐药性的监测和监控[6-7]。本研究发现，24株产ESBLs大肠杆菌中，ESBLs耐药基因blaCTX-M和blaSHV阳性率分别为19/24和17/24，且存在着多种亚型，如本研究发现blaCTX-M阳性率为19/24，其中主要存在着blaCTX-M-14，blaCTX-M-15，blaCTX-M-27，blaCTX-M-3，blaCTX-M-24等五种 亚 型 ，同 时 存 在 着 blaSHV-11，blaSHV-12，blaSHV-38，blaSHV-2a，blaSHV-28，blaSHV-26。表明医院环境中 ESBLs基因类型存在多样性，需警惕新亚型的出现。24株ESBLs阳性菌，除了携带有ESBLs基因，同时携带有其他抗生素水解基因，如磺胺类、氯霉素、四环素、氨基糖苷类及氟喹诺酮类抗生素耐药基因。表明24株ESBLs菌均为多重耐药菌。此外，从24株ESBLs阳性菌中检测出I型整合子有10个，且存在同时携带I型和II型整合子的菌株。整合子菌株基因结构以dfrA17-aadA5和dfrA12-orfF-aadA2为主。整合子是耐药菌株水平传播的重要方式，可能促进了耐药基因的传播。

4 结 论

泸州地区医院环境中产ESBLs大肠杆菌耐药水平较高，主要携带有blaCTX-M-14和blaSHV12等ESBLs耐药基因，且存在着多种亚型，同时携带有耐四环素、氯霉素、氨基糖苷类及氟喹诺酮类耐药基因。因此，需警惕医院环境中耐药菌传播。