细菌内毒素检测方法及其临床应用

沈银忠

摘 要 细菌内毒素可引起发热、微循环障碍、内毒素血症、脓毒性休克和弥散性血管内凝血等。鲎试验法是最常用的内毒素检测方法，其分为凝胶法和光度测定法，后者又可分为浊度法和显色基质法。内毒素检测对革兰阴性菌感染诊断具有重要的参考价值，也用于药品、医疗器械和环境的内毒素监测。内毒素检测对细菌感染诊断的敏感性与革兰阴性菌的种类有关，临床上可联用内毒素检测和其他检测手段如降钙素原检测来提高感染早期诊断的准确性。

关键词 细菌内毒素 鲎试验 革兰阴性菌感染 内毒素血症

中图分类号：R446.112 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2018）21-0003-04

Bacterial endotoxin test and its clinical application

SHEN Yinzhong*（Department of Infection & Immunity， Shanghai Public Health Clinical Center， Fudan University， Shanghai 201508， China）

ABSTRACT Bacterial endotoxin can cause fever， microcirculatory disturbance， endotoxemia， septic shock and disseminated intravascular coagulation. Limulus amoebocyte lysate （LAL） assay is the main method for endotoxin detection， which can be divided into gel and photometric methods， and the latter includes turbidimetric method and chromogenic substrate method. LAL assay has an important reference value in the diagnosis of Gram-negative bacterial infection and can also be used for endotoxin test in drug， medical device and environment. The sensitivity of endotoxin test for the diagnosis of bacterial infection depends on the Gram-negative bacterial strains. Clinical endotoxin test can be used together with other tests such as procalcitonin to improve the accuracy of early diagnosis of infection.

KEy WORDS bacterial endotoxin； limulus amoebocyte lysate assay； Gram-negative bacteria infection； endotoxemia

细菌内毒素是革兰阴性菌细胞壁外膜中的一种组分，主要成分是脂多糖，后者由细菌细胞壁合成后轉运到细胞表面，细菌死亡或自溶后会从细菌细胞结构中释放出来。内毒素耐热而稳定，抗原性弱，可刺激机体产生抗体（但无中和作用），形成抗毒素。内毒素经甲醛处理不能转变为类毒素。内毒素由O-多糖、核心多糖和类脂A组成[1]，其中类脂A是内毒素的毒性中心。不同革兰阴性菌的类脂A结构基本相似，在它们所引起的感染中，内毒素导致的毒性效应也大致类同。内毒素的毒性作用虽较弱，但可引起发热、微循环障碍、内毒素血症、脓毒性休克和弥散性血管内凝血（disseminated intravascular coagulation， DIC）等。内毒素检测对革兰阴性菌感染诊断具有重要的参考价值，有助于早期判断感染类型及是否存在内毒素血症，有利于指导临床用药及判断患者预后[2]。对易引入内毒素的药品和医疗器械等，出厂前必须进行内毒素检测。本文介绍内毒素检测方法及其临床应用的概况。

1 内毒素的生物学活性及对机体的影响

内毒素是细菌生长或死亡时释放出来的，环境中存在着大量的内毒素。当内毒素通过消化道等途径进入机体后并无危害，少量内毒素经注射等方式进入血液后亦可被肝脏巨噬细胞灭活，不会造成机体损害。但内毒素大量进入血液，作为外源性致热源作用于机体，则可使机体释放内源性致热源，进而引起发热。内毒素大量进入并集聚于血液中还可引起不同程度的内毒素血症。

内毒素血症由细菌释放出大量内毒素至血液或输入大量内毒素污染的液体所引起，在感染、严重创伤、肝功能障碍和免疫力下降等状态时均可发生内毒素血症并使机体出现一系列的病理生理学改变[2]：①发热；②引起组胺、5-羟色胺、前列腺素、激肽等血管活性物质释放，导致微循环扩张，静脉回流血量减少，血压下降，组织灌流不足、缺氧和酸中毒等；③激活补体；④激活凝血和纤溶系统，产生出血倾向和DIC；⑤直接或间接损害肝脏，引起糖和蛋白代谢改变；⑥激活巨噬细胞、单核细胞和内皮细胞活性。内毒素血症的临床表现包括发热、白细胞增多或减少、出血倾向、心力衰竭、肾功能减退、肝脏损伤、神经系统症状、多器官功能衰竭、DIC和休克等。

自19世纪发现脂多糖是一种能够引发致命性休克的革兰阴性菌细胞壁毒素以来，人们一直在研究内毒素在脓毒血症发病中所起的作用。严重感染、脓毒血症和多器官功能衰竭时，血浆脂多糖水平升高，但病毒感染时不升高，局灶性感染或轻微感染时一般也不升高。脂多糖不仅是脓毒性休克的诱发因素，且与动脉粥样硬化、酒精性肝病、自身免疫性疾病、代谢综合征、肾损伤、器官移植排异反应、创伤性脑损伤、肥胖、多器官功能衰竭、抑郁症、慢性疲劳、人获得性免疫缺陷病毒感染和2型糖尿病等多种疾病的发生有关，临床上发现这些疾病患者血浆、血清或组织中的内毒素水平升高[3-4]。有研究显示，慢性肾衰竭、包括血液透析患者可出现持续的血内毒素水平升高，同时伴随血促炎细胞因子如α-肿瘤坏死因子等水平升高[2]。内毒素水平升高可能与肾衰竭患者接受血液透析时液体改道导致的肠道通透性改变有关，此会导致内毒素转位。血液透析后，这类患者的内毒素水平显著下降。

2 内毒素的检测方法

2.1 鲎变形细胞溶解物（limulus amoebocyte lysate， LAL）试验

内毒素的检测常用家兔热原法和LAL试验（简称为“鲎试验”）法。家兔热原法是检测内毒素的第一种标准方法，鲎试验法则是目前最常用的内毒素检测方法。我国药典收载的细菌内毒素检测方法为鲎试验法，包括2种方法，即凝胶法和光度测定法，后者又包括浊度法和显色基质法。当各种检测法得到的检测结果不一致时，以凝胶法的检测结果为准。检测过程中应防止内毒素污染。鲎试验法检测须使用鲎试剂。鲎试剂是从海洋节肢动物鲎的血液中提取其变形细胞溶解物、再经低温冷冻干燥制成的一种生物试剂，其因能与内毒素和（1，3）-β-D-葡聚糖反应形成凝胶而被广泛用于检测食品、水源、药品、医疗器械以及动物和人体体液等不同样本中的内毒素。鲎的血液和淋巴液中有一种有核的变形细胞，这种细胞胞浆内有大量的致密颗粒，内含凝固酶、C-因子、B-因子和凝固蛋白原等。内毒素与鲎试剂接触后可激活C-因子，激活的C-因子又可激活B-因子或由（1，3）-β-D-葡聚糖激活G-因子，激活的B-或G-因子可再激活凝固酶原，使之转变为凝固酶，继而使可溶性的凝固蛋白原转变成凝固蛋白，由此使鲎试剂变为凝胶状态[1， 3-4]。凝固酶对鲎三肽有酰氨酶活性，可使硝基苯胺游离而发生生色反应。鲎试验法有定性和定量之分，其按试验方法还可进一步分为凝胶法、动态浊度法、终点浊度法、动态显色法和终点显色法。

凝胶法系应用鲎试剂可与内毒素发生凝集反应的原理来定性或半定量检测内毒素的一种鲎试验法，检测时鲎试剂须以除热原水（内毒素检查用水）复溶后使用，通过观察有无凝胶形成作为检测终点。凝胶法检测操作简便、经济，不需使用专用检测设备。

动态浊度法、终点浊度法、动态显色法和终点显色法都是内毒素的定量检测方法。动态浊度法和终点浊度法都属浊度法。浊度法是通过检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化来检测内毒素含量的鲎试验法，其中动态浊度法检测反应混合物浊度升高至某一预先设定的吸光度时所需的时间或浊度升高的速率。动态显色法和终点显色法都属显色基质法。显色基质法是通过检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物游离出生色团的多少来检测内毒素含量的鲎试验法，根据产物色度计算内毒素水平，又被称为比色法。

动态浊度法和动态显色法检测都须有带温育系统的动态光度测定仪器及其配套软件。动态浊度法和动态显色法检测操作简便、线性范围宽。终点显色法检测须有配套的酶标仪或可见分光光度仪。

就定量检测而言，比较同一个体内毒素水平的变化较比较不同个体或不同方法检测到的内毒素水平的差异更有意义。内毒素可被捕获在血凝块中，因此选用血浆样本检测内毒素较选用血清样本检测更好（检测时建议使用低浓度肝素）。检测时应防止环境内毒素的污染。

定性鲎试验法主要用于药品、医疗器械等样本的内毒素监测。定量鲎试验法主要用于临床患者的内毒素检测，为其临床诊治提供参考。一项研究显示，对血液透析患者的内毒素检测，动态浊度法的检测结果较显色基质法更为准确[5]。

（1，3）-β-D-葡聚糖是真菌细胞壁的主要组分，鲎试剂中含有对其敏感的G-因子和会转变并形成凝胶的凝固蛋白原。使用鲎试剂检测（1，3）-β-D-葡聚糖的试验被称为G-试验，临床上用于侵袭性真菌感染的早期诊断。

2.2 替代检测方法

鲎是珍稀动物，保护力度越来越大。因此，研发鲎试验的替代方法成为当务之急。替代方法主要有蛋白染色法、荧光偏振法、同位素标记法和酶联免疫测定法等。不过，这些替代方法的临床应用价值仍待进一步研究或确认，目前临床上应用最多的依然是鲎试验法。

3 内毒素检测的应用

3.1 内毒素检测在疾病诊治中的应用

血浆内毒素可来源于感染的局部组织、血液、胃肠道或呼吸道、或食物及其他摄入物中的细菌。血液中的内毒素通常归因于从胃肠道转位而来的脂多糖，胃肠道中的革兰阴性菌可产生大量的脂多糖并进入血液。内毒素与多种感染性疾病密切相关，是革兰阴性菌感染的重要标志。内毒素检测既可用于感染的鉴别诊断，也可用于监测炎症活动，在重症医学科、感染科、血液科、烧伤科、呼吸科、消化科、急诊科、透析科、妇产科、小儿科和肿瘤科等临床科室中得到广泛应用。

内毒素检测在临床上主要用于感染性疾病、尤其是革兰阴性菌感染的诊断，可帮助临床医生合理使用抗菌药物。内毒素水平升高提示细菌感染可能，非细菌感染性疾病患者的内毒素水平往往并不升高，病毒感染性疾病患者的内毒素水平也不升高。内毒素检测在临床上较多用于脓毒血症的辅助诊断。脓毒血症和脓毒性休克患者常有内毒素水平急剧升高的表现。一项研究显示，内毒素检测在诊断革兰阴性菌感染上的敏感性达85.3%，排除革兰阴性菌感染的阴性预测值为98.6%，排除感染的阴性预测值为94.8%[6]。不过，一项荟萃分析却显示，在铜绿假单胞菌和变形杆菌所致菌血症患者中，内毒素血症的阳性率分别为69%和76%，均高于无菌血症患者；但在大肠埃希菌所致菌血症患者中，内毒素血症的阳性率只有57%[7]。内毒素血症与革兰阴性菌菌血症之间的一致性与细菌种类有关，其中在大肠埃希菌所致菌血症中，这种一致性较差。此研究结果提示，内毒素检测对革兰阴性菌菌血症的诊断价值与细菌种类有关，内毒素检测结果与革兰阴性菌菌血症诊断之间的一致性偏低。总体来说，内毒素血癥的检出并不能准确鉴别革兰阴性菌感染或菌血症，其对排除革兰阴性菌感染或菌血症的价值可能更大[2]。有研究表明，慢性炎症性肠病、肝病和慢性代谢性疾病如肥胖、糖尿病等患者均可出现内毒素水平升高现象[4]。需注意的是，内毒素检测结果阴性并不完全排除基础疾病可致内毒素水平异常，而高水平的内毒素也不一定反映患者疾病的严重性。需注意的还有，某些情况如免疫球蛋白治疗后可引起内毒素检测结果呈假阳性。尽管有这些局限性，鲎试验法仍是评估革兰阴性菌感染的有价值的工具。降钙素原检测常用于判断有无感染可能，临床上联用内毒素和降钙素原检测有助于感染性疾病的早期诊断。

内毒素检测也常用于监测存在严重感染风险的患者，这类患者主要包括：免疫缺陷如器官移植后、艾滋病和长期服用免疫抑制剂的患者；重症医学科患者；重大手术后患者等。内毒素在脓毒血症和全身严重细菌感染时才会被释放，因此内毒素检测可用于监测严重感染的发生。有研究显示，接受心脏手术和严重创伤的患者也可出现内毒素水平升高，其原因可能与低灌注导致的肠道损伤使得脂多糖转位进入血液循环有关[8]。对重症医学科患者，临床上怀疑感染却无微生物学证据时，内毒素检测可帮助监测患者是否存在感染可能，对指导抗菌药物的使用具有极为重要的作用[8]。

内毒素检测还可用于评估疾病进展和患者预后[2]。内毒素水平升高是炎症活动性的反映。疾病恶化往往伴随内毒素水平升高，疾病缓解也常伴随内毒素水平降低。内毒素水平持续升高常提示患者预后不良。研究显示，高内毒素水平会提高严重脓毒血症发生的风险和重症医学科患者的病死率[8]。荟萃分析也发现，对非重症医学科患者，革兰阴性菌菌血症和内毒素血症是病死率升高的预测因素[9]。内毒素血症对革兰阴性菌菌血症患者病死率的预测价值与细菌种类有关，可预测非大肠埃希菌肠杆菌科细菌感染患者的病死率，但不能用于预测大肠埃希菌感染患者的病死率[10]。

3.2 内毒素检测在其他领域中的应用

内毒素检测还常用于注射用药品、医疗器械以及环境的内毒素监测。

4 内毒素检测的局限性

内毒素检测也存在很多局限性[3]，例如：内毒素检测方法多种多样，检测结果之间可能存在很大的差异；脂多糖的结构、溶解度等物理性质以及生物活性都存在很大的异质性，如何解读内毒素检测结果也一直存在不同的观点；脂多糖在有些革兰阳性菌感染患者体内也能检出，但在有些革兰阴性菌感染患者中却不能检出；血浆内毒素水平与炎性标志物水平或代谢指标值变化之间的关系并不确定。患者样本中存在的一些物质可能会影响内毒素检测的准确性。样本采集过程中防止内毒素污染亦至关重要。此外，内毒素检测结果可因所用检测试剂生产厂家及其生产批次的不同而出现差异。

根据鲎试验法原理可知，鲎试剂與脂多糖和（1，3）-β-D-葡聚糖都可发生反应而使检测结果呈阳性，即鲎试验法用于内毒素检测存在假阳性结果的可能[4， 11]。长期接受血液透析治疗患者的内毒素检测阳性率高，其中就可能包括因受（1，3）-β-D-葡聚糖影响而出现的假阳性结果。使用去G-因子的鲎试剂可提高内毒素检测的准确性。

文献分析结果显示，内毒素检测用于细菌感染诊断的敏感性与革兰阴性菌的种类有关，其中用于铜绿假单胞菌感染诊断的敏感性通常高于肠杆菌科细菌如大肠埃希菌感染诊断的敏感性[4]。

5 小结

内毒素是革兰阴性菌细胞壁外膜中存在的一类具有广泛生物活性的物质，可引起发热、微循环障碍、内毒素血症、脓毒性休克和DIC等。内毒素检测主要通过鲎试验法来进行，分为凝胶法和光度测定法，后者又分为浊度法和显色基质法。内毒素检测对革兰阴性菌感染诊断具有重要的参考价值，可帮助早期判断感染类型及是否存在内毒素血症，有利于指导临床用药及判断患者预后。内毒素检测也常用于注射用药品、医疗器械以及环境的内毒素监测。内毒素检测对细菌感染诊断的敏感性与革兰阴性菌的种类有关，临床上可联用内毒素检测和其他检测手段如降钙素原检测来提高感染早期诊断的准确性。内毒素检测方法多种多样，检测结果之间可能出现很大的差异，检测结果的解读应结合患者病情作综合分析。基于已有的研究数据，目前并不推荐对患者常规进行内毒素检测。

参考文献

[1] Su W， Ding X. Methods of endotoxin detection [J]. J Lab Autom， 2015， 20（4）： 354-364.

[2] Cohen J. The detection and interpretation of endotoxaemia[J]. Intensive Care Med， 2000， 26（Suppl 1）： S51-S56.

[3] Munford RS. Endotoxemia — menace， marker， or mistake？[J]. J Leukoc Biol， 2016， 100（4）： 687-698.

[4] Gnauck A， Lentle RG， Kruger MC. Chasing a ghost？— Issues with the determination of circulating levels of endotoxin in human blood [J]. Crit Rev Clin Lab Sci， 2016， 53（3）： 197-215.

[5] Wong J， Davies N， Jeraj H， et al. A comparative study of blood endotoxin detection in haemodialysis patients [J/OL]. J Inflamm （Lond）， 2016， 13： 24 [2018-10-06]. doi： 10.1186/ s12950-016-0132-5.

[6] Marshall JC， Foster D， Vincent JL， et al. Diagnostic and prognostic implications of endotoxemia in critical illness： results of the MEDIC study [J]. J Infect Dis， 2004， 190（3）： 527-534.

[7] Hurley JC， Nowak P， ？hrmalm L， et al. Endotoxemia as a diagnostic tool for patients with suspected bacteremia caused by gram-negative organisms： a meta-analysis of 4 decades of studies [J]. J Clin Microbiol， 2015， 53（4）： 1183-1191.

[8] Romaschin AD， Klein DJ， Marshall JC. Bench-to-bedside review： clinical experience with the endotoxin activity assay [J/OL]. Crit Care， 2012， 16（6）： 248 [2018-10-06]. doi： 10.1186/cc11495.

[9] Hurley JC， Guidet B， Offenstadt G， et al. Endotoxemia and mortality prediction in ICU and other settings： underlying risk and co-detection of gram negative bacteremia are confounders[J/OL]. Crit Care， 2012， 16（4）： R148 [2018-10-06]. doi： 10.1186/cc11462.

[10] Hurley JC， Opal SM. Prognostic value of endotoxemia in patients with Gram-negative bacteremia is bacterial species dependent [J]. J Innate Immun， 2013， 5（6）： 555-564.

[11] Wong J， Zhang Y， Patidar A， et al. Is endotoxemia in stable hemodialysis patients an artefact？ Limitations of the limulus amebocyte lysate assay and role of （1→3）-β-D-glucan [J/ OL]. PLoS One， 2016， 11（10）： e0164978 [2018-10-06]. doi： 10.1371/journal.pone.0164978.