蓝莓Vc ACS基因的克隆与表达分析

陈秋红 韦鹏飞 喻泱华 谭攀 郭崇炎 王志龙

摘 要：1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶基因（ACS）编码的蛋白是控制植物体内乙烯合成的关键限速酶，在植物发育、果实成熟、性别决定及抗逆境等过程中都发挥着重要调控作用。该研究采用RT-PCR和RACE技术首次从高丛蓝莓中获得了ACS基因的全长cDNA序列。该基因的cDNA序列全长为1747bp，其开放阅读框长为1323bp，编码440个氨基酸，命名为Vc ACS。Vc ACS为亲水性蛋白，无跨膜结构域，预测定位于细胞核或细胞质，含有AAT_like-吡哆醛-5-磷酸保守结构域。进化树分析表明，蓝莓Vc ACS蛋白和中华猕猴桃ACS蛋白的亲缘关系最近。转录表达水平检测结果表明，VcACS基因主要在花托、花瓣、雄蕊和根中表达，在花托中表达量最高，在嫩茎有低水平的表达，在叶中不表达。PEG6000（干旱）、低温和乙烯利都能诱导Vc ACS基因的表达上调，但表达水平存在差异。该研究成果为蓝莓ACS基因的进一步利用奠定了基础。

关键词：蓝莓；ACS基因；生物信息学分析；表达分析

中图分类号 S663.9 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）21-0010-07

Cloning and Expression Analysis of Vc ACS Gene from Blueberry

Chen Qiuhong et al.

（College of Agricultural，Hunan Agriculture University，Changsha 410128，China）

Abstract：The protein，1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase gene （ACS）is a key rate-limiting enzyme for controlling ethylene synthesis in plants.It plays an important role in plant development，fruit ripening，sex determination and stress resistance.In this research，the full-length cDNA sequence of ACS gene was obtained from highbush blueberry for the first time using RT-PCR and RACE technology.The full-length cDNA sequence of the gene was 1747bp，and its open reading frame was 1323bp，encodes 440 amino acids，named Vc ACS.Vc ACS is a hydrophilic protein with no transmembrane domain.It is predicted to be located in the nucleus or cytoplasm and contains the conserved domain of AAT_like-pyridoxal-5-phosphate.Phylogenetic tree analysis showed that the kinship between Vc ACS protein and ACS protein of Actinidia chinensis was the closest.The results of transcriptional expression analysis showed that Vc ACS gene was mainly expressed in receptacles，petals，stamens and roots，with the highest expression in receptacles and low expression in tender stems，but was not expressed in leaves.PEG6000 （drought），low temperature or ethephon treatment all could induce the expression of Vc ACS gene，but the expression level and induction speed were different.This research lays the foundation for the further utilization of the ACS in blueberry.

Key words：Blueberry；ACS gene；Bioinformatics analysis；Expression analysis

乙烯（ethylene）是一种重要的植物内源性气体激素，参与调控植物种子的萌发、性别分化、果实成熟、生物和非生物胁迫等多种植物生长发育过程[1-4]。乙烯的生物合成是一个复杂的生物化学反应过程，首先蛋氨酸由腺苷蛋氨酸合成酶催化生成腺苷蛋氨酸，之后腺苷蛋氨酸再由ACC合成酶（l-aminocyclopropane-1-carboxlic acid synthase，ACS）催化生成 ACC（l-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC），最后ACC在ACC氧化酶（l-aminocyclo Pro Pane-1-carboxylic acid oxidase，ACO）的作用下生成乙烯[5，6]。由此可知，在乙烯生物合成途徑中，ACS是一个关键的限速酶。ACS的合成是受到ACS基因编码的，但ACS在一般植物组织中含量低，而受生物、非生物胁迫因子诱导进行从头合成，且不易被分离纯化[7]。植物中编码ACS的基因大多是家族基因。目前，研究者已从部分植物中克隆了ACS基因，如在番茄中克隆了9种ACS基因，在拟南芥中克隆了12种，在水稻种分离了5种等等[8]。植物中，不同的ACS基因在植物发育的不同阶段、抗各类生物胁迫、非生物胁迫等具有不同作用。

目前，研究者在很多植物中不仅分离到了ACS基因，并对其进行了相关功能研究。在天竺葵克隆的4个ACS基因中，pGAC-1G在茎、叶、花蕾、花瓣、雌蕊中大量表达，但在根中几乎检测不到；且ABA能强烈诱导pGAC-1G在叶中的转录表达。pGAC-2G在根中表达量较丰富，在叶和雌蕊中呈中等表达强度，在茎和花蕾中表达量较低，在花瓣中几乎检测不到；在叶片中，pGAC-2G对黑暗处理具有一定程度的响应表达。Pz ACS3几乎仅在根中表达，无论何种处理，都不能诱导PzACS3在叶中的转录表达。Pz ACS4在花蕾中表达水平较高，在茎、叶和花瓣中表达水平相对中等，在雌蕊中表达量较低，在根中不表达；无论是黑暗、ABA、乙烯、TDZ处理或者是对照未处理组，PzACS4在叶中均呈现组成性表达模式[9]。番茄的9个ACS基因中，Le ACS1A、Le ACS2、Le ACS3与Le ACS6 都具有调控果实成熟的功能，但是它们的表达模式并不相同[10]。苎麻Bn ACS1基因在苎麻的根、茎、茎尖、叶片、雌花和雄花中均有表达，且在根系和雄花中表达较高；ABA和干旱处理都能诱导Bn ACS1组织表达水平发生变化，而高盐处理后Bn ACS1在根、茎尖和叶片中均不表达[11]。罗汉果Sg ACS1基因在检测的植株各个部位和各个发育时期均有表达，在授粉后的雌株花蕾中相对表达量最高，其次是授粉前后雌株的花和取粉前后雄株的芽；银离子处理后的雌株在授粉后的花蕾和芽中Sg ACS1的相对表达量最低[12]。对黄瓜F2分离群体中的性别表型分析表明，CS-ACS1G基因标记与性别决定基因F位点具有100%相关性，在黄瓜花性别决定上起了关键作用；通过对黄瓜基因组DNA的Southern杂交和SCAR标记分析，发现CS-ACS1G基因为雌性系和亚雌性系所特有[13，14]。转反义ACS基因的番茄在采后贮藏过程中的乙烯生成量很低，而且对番茄果腐病病原菌侵染的抗性显著提高[15]。把反义ACS基因导入番茄还能显著减缓番茄果实的成熟衰老速度；而当用乙烯利处理后，果实就会成熟变软，其果实品质与正常果无异，这种耐贮保鲜性的转基因番茄具有明显的经济价值[16]。水稻中，Os ACS1和Os ACS2能被稻瘟病菌诱导表达；二化螟、稻纵卷叶螟和褐飞虱为害都能快速诱导水稻中Os ACS2的表达[17，18]。

蓝莓（Vaccinium corymbosum L.）又称为越橘、蓝浆果，为杜鹃花科（Ericaceae）越桔亚科（Vaeeinioideae）越桔属（Vaccinium）多年生落叶灌木或常绿灌木，约有450种，一般可分为高丛蓝莓、矮丛蓝莓和兔眼蓝莓3种类型[19，20]。蓝莓果实营养丰富，含有花青苷、绿原酸、超氧化物歧化酶及不同维生素等生物活性成分，对治疗癌症、糖尿病、高血压等都有益处，被誉为“浆果之王”[21，22]。目前，人们对蓝莓基因工程方面的研究多集中在抗逆基因和次生代谢产物相关基因[23-25]，而对蓝莓果实成熟相关的基因研究很少。为此，本研究通过RT-PCR和RACE技术，首次获得了可能与蓝莓果实成熟相关的Vc ACS基因的全长cDNA序列，对此序列进行了相关生物信息学分析，并通过qRT-PCR技术分析了该基因的组织表达特性和胁迫表达特性，为今后进一步深入揭示蓝莓Vc ACS基因在果实成熟和生物胁迫、非生物胁迫过程中的作用及果树育种利用方面的作用奠定坚实基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 试验蓝莓“圆蓝”属于高丛蓝莓，为5年龄成熟树苗，移栽自宜春蓝玉农业开发有限公司，种植在本实验室的果圃里，并经过组织培养获得蓝莓组培苗。在蓝莓生殖生长期间，取其不同组织器官，用于检测Vc ACS基因的组织表达特性。选取生长健壮且长势相近的、已经培养了2个月的“圆蓝”组培苗为实验材料[26]，经不同胁迫处理后，检测Vc ACS基因胁迫条件下的表达特性。

1.1.2 试验试剂 总RNA抽提采用百泰克通用植物总RNA提取试剂盒（RP3302），反转录前采用Thermo Scientific公司DNAseI处理总RNA样，cDNA第一链合成采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Scientific）试剂盒。SYBR? Premix Ex Taq?II （TliRNaseH Plus）和SMARTer? RACE 5′/3′Kit购自宝日医生物技术（北京）有限公司。金牌PCR MIX（高保真）、2×TSINGKE Master Mix、DL2000 DNA Marker均购自北京擎科新业生物技术公司。引物合成及基因测序在生工生物工程（上海）股份有限公司进行。大肠杆菌感受态Trans1-T1、克隆载体试剂盒pEASY-Blunt Zero Cloing Kit购买自北京全式金生物技术有限公司。胶回收试剂盒购自Omega Bio-Tek公司。质粒抽提试剂盒在生工生物工程（上海）股份有限公司购买。其他试剂均为国产分析纯级。

1.2 方法

1.2.1 蓝莓Vc ACS基因的克隆 根据GenBanK中已知的甜橙Cs ACS1（Citrus sinensis，CAB60721.1）、苹果Md ACS3b（Malus domestica，BAE94691.1）、沙梨Pp ACS2（Pyrus pyrifolia，BAA76388.1）、枇杷Ej ACS（Eriobotrya japonica，ACT54524.2）和龙眼Dl ACS（Dimocarpuslongan，ACM48506.3）蛋白的保守区域设计引物（表1），以蓝莓“圆蓝”茎、叶和盛花期全花的混合cDNA为模板，用金牌PCR MIX（高保真）进行PCR，扩增Vc ACS基因的保守区段。PCR扩增条件为：95℃、5min预变形后，95℃、30s、56℃、30s、72℃、30s，此3步循环33次，最后72℃延伸5min。扩增得到的PCR产物经电泳后切胶回收目的条带，回收产物与pEASY-Blunt Zero Cloing载体连接，连接产物转化大腸杆菌感受态Trans1-T1，转化后感受态经复苏后涂皿。过夜生长后挑单克隆进行菌落PCR鉴定，将阳性单克隆摇菌后提质粒进行酶切验证，验证正确后送测序，得到蓝莓Vc ACS基因部分保守区段序列；再以该保守序列为基础，设计3′RACE和5′RACE引物，并扩增得到相应片段，经克隆测序得到片段序列。最后将所得保守序列、3′RACE序列和5′RACE序列进行拼接，设计扩增Vc ACS基因全长cDNA序列的引物（表1）。经扩增、克隆、测序后，得到蓝莓Vc ACS基因全长cDNA序列。

1.2.2 生物信息学分析 蓝莓Vc ACS蛋白的理化特性、亲疏水性、跨膜结构、二级结构、三级结构和亚细胞定位结果分别通过在线软件Protparam（https：//web.expasy.org/protparam/）、ProtScale（http：web.expasy.org protscale）、TMHM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、GOR （http：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_gor4.html）、Phyr2 （http：http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre2/html/page.cgi？id=index）和WOLF PSORT （https：//www.genscript.com/tools/wolf-psort）分析得到；用ClustalX2.0软件进行蛋白氨基酸多序列比对，用MEGA6.06软件的邻近相连法（NJ）构建系统发育进化树。

1.2.3 蓝莓 Vc ACS基因的转录表达谱分析在蓝莓生殖生长期分别取其根、嫩茎、叶、盛花期花瓣、花托、雄蕊、雌蕊以及蓝莓幼果（花后7d）等组织器官样品，锡箔纸包好后立即用液氮速冻，存于-80℃冰箱，用于基因组织转录表达特性分析。以“圆蓝”组培苗为实验材料，分别用20%PEG6000、4℃和2mmol/L乙烯利（ETH）进行干旱、低温和外源乙烯利胁迫处理，并在处理0h、1h、6h、12h和24h时分别整株取样，锡箔纸包好后立即用液氮速冻，存于-80℃冰箱，用于基因胁迫转录表达谱分析。分别提取蓝莓不同组织器官及不同胁迫处理后的RNA，合成cDNA第1链。根据蓝莓Vc ACS全长cDNA序列设计荧光定量PCR引物ACS-qRT-F和ACS-qRT-R，以Vc GAPDH基因为内参（引物见表1），检测蓝莓Vc ACS基因的转录表达水平。

2 结果与分析

2.1 蓝莓ACS基因的克隆与序列分析 以蓝莓嫩茎、叶和盛花期全花的混合cDNA为模板，扩增得到Vc ACS基因保守区段条带（图1A），经克隆测序后发现其大小为994bp。用该保守序列设计5′RACE引物、3′RACE引物，扩增得到5′RACE片段（图1B）和3′RACE片段（图1C），经克隆测序后发现其大小分别为1309bp和727bp。将保守序列、3′RACE序列和5′RACE序列拼接后，获得Vc ACS基因的全长cDNA序列。设计扩增全长cDNA的引物并扩增得到Vc ACS基因的全长cDNA序列片段（图1D），经克隆测序后发现其大小为1747bp。该序列经DNAstar软件分析和 GenBank 数据库 BLAST 比对后，确定该基因开放阅读框长为1323bp，编码440个氨基酸（图2），命名为Vc ACS。

A.cDNA保守区段扩增 B.5′RACE扩增 C.3′RACE扩增 D.全长cDNA扩增

2.2 蓝莓Vc ACS蛋白理化性质及功能预测分析 利用Protparam在线软件分析Vc ACS蛋白的理化特性，结果表明，蓝莓VcACS基因所编码蛋白分子式为C2208H3422N596O673S19，相对分子质量为4.96kD，理论等电点是5.20，脂溶指数为79.34，总平均亲水性值为-0.350。利用ProtScale软件对该蛋白氨基酸进行疏水性分析，由图3A结果可知，其疏水性最大值为1.756（第125位氨基酸位处），最小值为-3.178（第335位氨基酸位处），总体上看该蛋白为亲水性蛋白，这与Protparam软件预测结果一致。用TMHM软件分析Vc ACS蛋白是否为跨膜蛋白，结果见图3（B），该蛋白不含跨膜结构域，不是跨膜蛋白。利用NCBI线上的CDD软件对Vc ACS蛋白的保守结构域进行分析（图4）。由图4可知，该蛋白是1个典型的1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase蛋白（PLN02607），含有AAT_I超家族特征结构域，属于Aminotran_1_2蛋白超家族。

使用在线软件GOR4对蓝莓Vc ACS蛋白进行二级结构分析，结果见图5（A），Vc ACS蛋白二级结构含有182个α-螺旋，71个延伸链和184个无规则卷曲，它们分别占到蛋白总氨基酸的41.36%、16.82%和41.82%。对Vc ACS蛋白进行相似三级结构模型建模，结果见图5（B），找到与其模型最相近的蛋白，为1-aminocyclopropane-1-carboxylate酶（ACS）。Vc ACS蛋白的415个氨基酸残基（占整个蛋白的94%）与此蛋白模型具有100%的相似度。利用WOLF PSORT预测分析该蛋白的亚细胞定位情况。结果显示，蓝莓Vc ACS蛋白可能定位于细胞核或细胞质。

2.3 蓝莓Vc ACS同源性比较与系统进化树分析 通過Genbank上的Blastx工具对Vc ACS蛋白序列进行同源性检索，选取11条同源性较高的植物ACS蛋白序列，即中华猕猴桃Acv ACS（Actinidia chinensisvar.chinensis，PSS01957.1）、毛白杨Pt ACS7（Populustrichocarpa，XP_002308289.1）、蓖麻Rc ACS7（Ricinus communis，XP_002514161.1）、栓皮栎Qs ACS7（Quercus suber，XP_023898923.1）、白花鹤望兰Hu ACS7（Herraniaumbratica，XP_021276619.1）、柑橘Cs ACS7（Citrus sinensis，XP_006475545.1）、桃树Pp ACS7（Prunus persica，XP_020424364.1）、白羽扇豆La ACS4（Lupinusalbus，AAF22108.1）、蔓花生Ad ACS7（Arachisduranensis，XP_015955230.1）、苹果Md ACS3c（Malus domestica，BAE94692.1）和野桑蚕Mn ACS7（Morusnotabilis，XP_010090013.1），利用ClustalX2.0软件进行序列同源性比对，结果见图6。共比较了448个氨基酸残基，保守的氨基酸残基达81.47%，有279个氨基酸残基在比较的所有物种中完全保守，占62.28%（上标“*”），有57个氨基酸残基高度保守，占12.72%（上标“：”），还有29个氨基酸残基较高度保守，占6.47%（上标“.”）。

在序列对比的基础上，为进一步了解蓝莓Vc ACS与其他植物ACS之间的进化关系，用以上12条植物ACS氨基酸序列构建系统进化树，由图7可知，这些物种的Vc ACS蛋白序列可以聚为以下2大类；在第1大类中，蓝莓和中华猕猴桃的ACS最先聚合，其ACS氨基酸序列相似性达99%，这说明Vc ACS在进化上与中华猕猴桃ACS亲缘关系相对最近；第2大类包括2个亚类，其中一类包括蓖麻、白花鹤望兰和毛白杨，另外一类包括栓皮栎、柑橘、桃树、白羽扇豆、蔓花生、苹果和野桑蚕。这说明蓝莓Vc ACS在进化上与这些物种的ACS亲缘关系相对较远。

2.4 蓝莓Vc ACS基因表达分析 采用荧光相对定量PCR技术检测蓝莓不同组织器官中的Vc ACS基因的转录表达水平，结果见图8。由图8可知，VcACS基因在蓝莓的根、嫩茎、花托、花瓣、雌蕊、雄蕊和幼果中表达，在叶片中不表达；在花托中表达量最高，其次是雄蕊和根，在花瓣和雌蕊中表达量相对较低，在嫩茎中几乎不表达。

对蓝莓组培苗进行不同的胁迫处理后，采用荧光相对定量PCR技术检测蓝莓Vc ACS基因相对表达变化水平，结果见图9。由图9可知，在PEG6000（干旱）处理1h时，蓝莓Vc ACS基因表达水平明显提升，比0h高了5倍左右而达到最高值；之后Vc ACS表达量下降，但仍比0h要更高，说明干旱能诱导Vc ACS基因的表达。在4℃低温处理后，Vc ACS基因受到诱导，其表达量随着处理时间延长而慢慢升高，并在24h达到最高值，为0h的7倍左右。乙烯利（ETH）处理蓝莓组培苗后，Vc ACS基因也受到了诱导，其表达水平随着处理时间延长而渐渐升高，在24h达到最大值，为0h的2倍左右。

3 讨论与小结

ACS基因是乙烯生物合成途径中的一个关键限速酶基因，在许多植物中都已经被克隆到，但是目前在蓝莓中还未见报道。本研究通过RT-PCR和RACE技术首次获得了蓝莓Vc ACS基因的全长cDNA序列。对此序列编码的蛋白质序列进行保守结构域分析后发现，该蛋白属于AAT_Ⅰ超家族，含有AAT_like-吡哆醛-5-磷酸保守结构域，具有典型的ACS基因家族结构特征；三级结构预测后也发现其与1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶的结构最为接近，进一步的同源性比较和进化树分析后表明，Vc ACS蛋白与其他物种的ACS蛋白高度同源。这些都说明所克隆得到的蓝莓Vc ACS基因是ACS基因家族成员之一。

ACS基因家族中的不同成员在植物的不同生长发育过程和不同逆境环境中起着不同的调控作用，并具有不同的转录表达模式。不同的ACS基因在植物不同组织中有的为组成型表达，有的是特异性表达。有些ACS基因受到各种逆境诱导表达[11]。‘云香水仙Nt ACS1基因在花瓣和副冠中的表达水平都是随着花的衰老而呈现逐渐下降的趋势，Nt ACS1基因在花瓣和副冠中的表达量最高值都在花苞期[27]。文心兰On ACS2基因在花蕊柱中表达量最高，其次是花萼、花瓣和叶片，而在根、茎及花唇瓣中的表达量很少[28]。小苍兰中的Fh ACS1基因在花朵不同器官的雄蕊中表达量最高，花瓣中次之，在雌蕊中最低；在花朵完全开放时表达量达到最高值，大部分开放时的表达量次之，完全衰老花朵中的表达量最低[29]。本研究中蓝莓Vc ACS基因在花的不同组织中的表达量高低是：花托>雄蕊>花瓣>雌蕊。这与文心兰中On ACS2基因和小苍兰中Fh ACS1基因表达情况很相似。前人研究表明，小苍兰花芽中检测到的95%的ACC均来自花药，花是产生乙烯的重要器官[30]。蓝莓Vc ACS表达量较高的几个组织都集中在花上，因而推测蓝莓的花器官是产生乙烯的重要部位。Vc ACS基因在检测的蓝莓大部分组织中都有表达，但在根、花等非绿色组织中表达量较高，但嫩茎和幼果等绿色组织中的表达量较低，在叶片中甚至不表达，这表明蓝莓Vc ACS基因具有明显的组织表达特异性。

前人研究发现，用乙烯利处理甘蔗幼苗后，甘蔗Sc-ACS1基因在叶中表达，在根中不表达；Sc-ACS2在根和叶中都表达；Sc-ACS3则主要在根表达，在叶中不表达；而且Sc-ACS1对低温、暗培养、LiCl胁迫和IAA处理都有响应[31]。罗汉果Sg ACS3基因在授粉前雌株叶和花芽中的表达水平较高；在Ag+处理前的雌株的花芽和叶中的相对表达量都明显高于Ag+处理后的雌株中的表达量[32]。在浸水处理并保持恒定光照和温度条件下的沼生酸模幼苗检测到了RP-ACS1基因的转录表达，而且其表達水平在处理的前12h相对较稳定，在处理24h后明显上升[33]。本研究发现，蓝莓Vc ACS基因可以受到PGE6000（干旱）、低温和外源乙烯的诱导表达，但对于不同胁迫的诱导时效和诱导水平具有显著差异，这表明该基因可能以不同的方式参与了蓝莓应对不同胁迫的反应。

本研究克隆得到的Vc ACS基因具有1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶基因的典型特征，是蓝莓中分离的第一个ACS基因。Vc ACS基因是否具有调控蓝莓果实发育及抗逆性等方面的功能还有待进一步深入研究。蓝莓Vc ACS的特征阐明和功能分析将有助于其进一步的应用。

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（责编：张宏民）