联用凝胶色谱净化和超高效液相色谱定量分析植物油中的苯并芘

房 芳 宁 晖 邵亮亮 杜京霖 高梦莎 赵美凤

(浙江省粮油产品质量检验中心，杭州 310012)

苯并芘［benzo(a)pyrene，B(a)P］是一种五环芳香烃类化合物，简称3，4－苯并芘，其化学结构式如图1。1933年，英国学者从煤焦油中分离出苯并芘，并诱发了小鼠皮肤癌，使B［a］P成为第一个被发现的化学致癌物［1－2］。我国对环境及食品中苯并芘的限量标准分别为空气质量日平均浓度小于0.001 μg/m3、生活饮用水小于 0.01 μg/L;肉制品、熏烤动物性食品及粮食小于 5.0 μg/kg、植物油小于 10 μg/kg［3－4］。食品中的苯并芘的主要来源包括:熏烤食品，大气灰尘和颗粒的沉降，油料的加工过程中炒制温度过高热解产生苯并芘［5］。

目前国内外关于苯并芘的常规检测方法有:荧光分光光度法［6］、薄层层析法、高效液相色谱法［7］、气相色谱－质谱(Gas Chromatography－Mass Spectrometer，GC －MS)联用法［8］等。由于苯并芘具有较强的亲油性，因此在粮油检测中，植物油中的苯并芘检测意义重大。食用油中苯并芘的检测分为样品的预处理和检测两个基本过程。由于食用油中的苯并芘含量少、稳定性差、在油中易吸附，且存在多种潜在干扰物质:如大量甘油三酯、脂肪物质等，降低了后续分析仪器的灵敏度，从而影响最终的分析结果，因此对样品的前处理要求很高。我国检测食用油中苯并芘主要采用国标(GB 5009.27—2016)［9］，前处理分为两种:一种采用中性氧化铝柱净化另一种采用苯并(a)芘分子印迹柱。这两种前处理方法都存在处理复杂、耗时长、试剂耗费量大、对人员要求高等问题，因此建立一种准确、简便、快速的前处理方法可以更好的为苯并芘定量定性工作提供重要的基础保障。凝胶渗透色谱(gel permeation chromatography，GPC)是利用多孔的凝胶聚合物将化合物按分子空间结构差异(分子质量大小)进行选择性分离，不能进入凝胶孔隙的分子会很快随流动相洗脱，而能够进入凝胶孔隙的分子，则需要更长的冲洗时间才能够流出固定相，从而实现对不同组分的分离［10］。利用这个原理，油脂中的苯并芘检测完全可以用凝胶色谱串联液相色谱完成，由于仪器的全自动化，大大减轻了填柱，过柱等人工劳动，且回收率也可达到90%以上。此外在检测过程中引入了超高效液相色谱，相较与高效液相色谱，灵敏度更高，出峰时间更快，大大提高了检测效率。

本研究拟在国标GB 5009.27—2016的基础上优化，建立一种植物油中定量检测苯并芘的方法，通过凝胶色谱对植物油样品进行净化，采用超高效液相色谱检测。并且按照欧盟2002/657/EC法规［11］标准对该方法进行方法学验证。应用该方法，可以实现植物油中的苯并芘半自动化检测，降低人工操作压力，提高检测通量;此外，还可以降低由人工操作引入的不确定度，提高检测精度。该方法的建立对常规实验室有不可忽视的积极意义。

图1 苯并芘分子结构

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

1290Infinity超高效液相色谱仪:美国安捷伦公司;Freestyle凝胶色谱:LCTech GmbH公司。

1.1.2 试剂

环己烷、乙酸乙酯［色谱纯，天地(TIDIA)公司，美国］;乙腈(色谱纯，默克公司，德国)，苯并芘标准品(浓度20 μg/mL，农业部环境保护科研检测所)。

1.2 实验方法

1.2.1 预处理条件

准确称取0.8 g油样加入10 mL乙酸乙酯和环己烷(1∶1，V∶V)混合溶液，取6.4 mL 上述溶液采用凝胶色谱净化。

凝胶色谱条件:色谱柱填料:Bio Beads s－X3聚乙烯凝胶填料;流速:4.5 mL/min;进样量:满环进样6.4 mL;淋洗液:乙酸乙酯和环己烷混合溶液(1∶1，V∶V);淋洗程序:前淋洗时间12 min，收集时间15 min，后冲洗时间10 min;收集的溶液在浓缩腔中进行溶剂转换，最后用1.5 mL乙腈定容。

1.2.2 液相色谱条件

色谱柱:Aglient Eclipse Plus C18(RRHD 1.8 μm 2.1 mm ×50 mm)带保护柱;流速0.1 mL/min;柱温30℃;流动相∶甲醇∶水(95∶5，V∶V);进样量:10 μL;检测器:荧光检测器，激发波长384 nm，发射波长406 nm。

1.2.3 标准曲线的建立

准确吸取0.5 mL苯并芘标准溶液用乙腈定容至10 mL容量瓶，得苯并芘标准中间液(1.0 μg/mL)，把苯并芘标准中间液(1.0 μg/mL)用乙腈稀释得到 0.5、1、5、10、20、40 ng/mL 的校准曲线溶液，按照1.2所述方法进样分析，以峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标，绘制标准品曲线。

2 结果与分析

2.1 凝胶色谱条件的确定

样品通过凝胶色谱净化，主要目的是将目标被测物与杂质分离开，提高检测的准确度和精密度。由于苯并芘在紫外没有特征波长，因此不能用过凝胶色谱－紫外在线分析确定收集时间。为了确定苯并芘的确切收集时间，采用分段收集的方法。由于油脂分子质量比较大，主要分布在前7 min的洗脱液中。在此之后，每4 min收集一管馏分，一直收集至35 min，共收集7管。收集的洗脱液转移至旋转蒸发瓶中蒸发至干后准确加入1.5 mL乙腈，混合1 min，过 0.45 μm 膜，滤液按 1.2.2 的液相色谱条件进行检测。通过结果分析(图2)，得到15－35 min的样液中含有苯并芘，因此确定收集时间为12－27 min。

图2 优化凝胶色谱洗脱时间

2.2 方法学验证

2.2.1 线性

本方法建立0.50～40.0 ng/mL的标准曲线溶液，按照2.2.1所述液相色谱条件进样分析后，以峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标，建立标准曲线溶液(见图3)。结果表明，上述标准曲线范围内，相关系数R2=0.999 93，苯并芘与色谱峰面积呈良好的线形关系，符合欧盟2002/657/EC法规中R2＞0.99的要求。

图3 苯并芘标准曲线

2.2.2 方法回收率

本文选取一个不含有苯并芘的植物油作为空白基质，加入苯并芘标准溶液制备加标样本。考虑到植物油的限量标准10 μg/kg，本方法选择了0.5倍、1倍和2倍的限量标准为加标浓度，制备了含量为5、10、20 μg/kg的加标样本，按照上文所述方法进行检测，共重复平行样本3次，结果见表1。验证结果显示，该方法加标回收率在88% ～92%之间，符合欧盟2002/657/EC法规在5～20 μg/kg浓度下，回收率应在60%～115%之间的要求。

表1 方法回收率

2.2.3 日间精密度

精密度验证采用2.2.2章节中相同的加标样品，按照上文所述方法进行检测，重复检测3 d，每天重复平行样本3次，检测结果见表2。验证结果显示，该方法日间精密度在1.4% ～2.2%之间，符合欧盟2002/657/EC法规在该浓度下，日间精密度应小于16%的要求。

表2 日间精密度

2.2.4 灵敏度

考虑到植物油的限量标准10 μg/kg，本研究以0.1倍限量标准，采用空白基质加标的方法，配制1 μg/kg的加标样本。该样本按照本文上述方法进行预处理和检测，色谱图如图4所示。该样本的信噪比为167.28。以3倍信噪比(3S/N)所对应的样品中标准品浓度为检出限(limit of detection，LOQ)，计算得该方法的检出限为0.018 μg/kg，以10倍信噪比(10S/N)所对应的样品中标准品浓度为定量限(limit of quantification，LOQ)，计算出该方法的定量限为 0.060 μg/kg。

3 结论

图4 样品图谱

本文所建立的植物油中的苯并芘检测方法，与现有的国标(GB 5009.27—2016)相比，在样品净化、检测方式上进行了改进。样品净化方面，本方法采用凝胶色谱法。凝胶色谱法可有效的去除样品中的脂类、色素、蛋白质等大分子干扰物质，从而减小基质效应、降低分析背景、改善色谱峰行。且凝胶色谱从上样、洗脱，浓缩，溶剂转换到最后的定容完全实现全自动化，一方面可以缩减繁琐的前处理工作，另一方面可以避免在前处理过程中带入的人员误差。在检测方式上引入了超高效液相，相比于传统的高效液相灵敏度更好，且检测时间大大缩减，提高了工作效率。该方法简单、快速、高效，为食用油中苯并芘的定性、定量分析提供了一种重要途径。