通关藤总皂苷提取工艺及抗肿瘤活性研究

李媛媛，贺石麟，白崇智，倪 艳，郝旭亮

（山西省中医药研究院，山西太原030012）

通关藤，又名通光藤、乌骨藤等，为萝摩科植物通关藤Marsdenia tenacissima（Roxb.）Wight et Arn.的干燥藤茎，味苦，微寒，归肺经，具有止咳平喘、祛痰、通乳、清热解毒之功效［1］。通关藤含有多种化学成分，包括C21甾体皂苷、三萜皂苷、多糖、醇类、挥发油、生物碱、有机酸等［2］。以通关藤单方水提取物制成的消癌平制剂，临床应用广泛，常用于各种消化系统肿瘤、肺癌、肝癌等的治疗，还可用于放疗、化疗的辅助治疗［3］。课题组前期研究表明通关藤多糖通过调整T细胞亚群分布异常而增强免疫低下小鼠的免疫功能［4］。已有研究表明C21甾体皂苷为通关藤主要抗肿瘤成分［5-7］，关于此类成分的提取纯化工艺研究未见报道。目前大孔树脂因其选择性好、吸附迅速、绿色环保等优势，常应用于天然产物的提取纯化［8］。本研究拟采用大孔树脂对通关藤甾体皂苷进行提取纯化工艺研究，通过测定其对肿瘤细胞的抑制作用，确证甾体皂苷为其抗肿瘤的活性成分，为通关藤药物进一步开发利用提供依据。

1 材料与试剂

通关藤药材，购于安国市药兴药材有限公司，经山西省中医药研究院李先荣主任药师鉴定为萝藦科植物通关藤的干燥藤茎；通关藤苷A实验室自制，纯度＞98%；香草醛、高氯酸、冰醋酸等化学试剂均为分析纯。

人肝癌细胞株Hepg2由山西医科大学惠赠。PBS、DMEM（高糖型）培养基购自Neuronbc公司；4%多聚甲醛固定液：博士德生物工程有限公司；青链霉素混合液、胰酶消化液、MTT、DMSO均购自Solarbio公司；特级胎牛血清购自北京元亨生物制品科技责任有限公司；顺铂注射液（6 mL：30 mg）购自江苏豪森药业股份有限公司。

TU1901紫外可见分光光度计（北京普析通用有限公司），DZKW-4电子恒温水浴锅（北京中兴伟业有限公司），BS223S电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司），电热恒温箱（北京市医疗设备厂），旋转蒸发器（上海亚荣有限公司），KDC-2046低速冷冻离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司），SHZ-C型循环水式多用真空泵（河南巩义市英峪华仪器厂），恒温水浴锅、LGJ-18A冷冻干燥机（北京四环科学仪器厂有限公司）。CelMate系列CO2培养箱，ESCO贸易有限公司；YZQ-B恒温摇床，上海双舜实业发展有限公司；Eppendorf Research移液枪，北京博仪恒业科技公司；WD-2102A自动酶标仪，北京市六一仪器厂。

D101、AB-8大孔树脂购自沧州宝恩吸附材料科技有限公司；ZTC-1、D3520、NKA-9 大孔树脂购自南开大学化工厂。参考厂家提供的信息对大孔树脂的理化性质总结如下（表1）。

2 通关藤总皂苷提取工艺研究

2.1 总皂苷的提取

表1 大孔吸附树脂的理化性质

以乙醇浓度、加醇量、提取时间和提取次数作为考察因素，每个因素选取3个水平，以总皂苷含量作为指标，选用L9（34）正交试验设计表，优化总皂苷提取工艺参数，以筛选最佳工艺条件及技术参数。提取方法是称取10 g通关藤药材，按试验设计条件，加热回流提取后趁热过滤，提取液减压浓缩并定容至100 mL，备用。各因素水平见表2。

表2 因素水平表

2.2 对照品溶液的制备

称取通关藤苷A对照品10 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解，定容，即得1.0 mg/mL通关藤苷A对照品溶液。

2.3 标准曲线的绘制

精密吸取 0.04 mL，0.06 mL，0.08 mL，0.10 mL，0.12 mL，0.14 mL 通关藤苷 A 对照品溶液，分别置于试管中，挥干溶剂，精密加入5%香草醛-冰醋酸溶液 0.4 mL，高氯酸 0.8 mL，摇匀，置 70 ℃水浴中加热15 min；取出，立即置于冰水浴中放置5 min，取出，加入10 mL冰醋酸，摇匀，以相应试剂为空白，按紫外-可见分光光度法（中国药典2015年版四部通则0401），于460 nm处测定吸光度，将吸光度A与对照品量C（mg）进行线性回归，得线性回归方程为：A=4.494 4C-0.156 5（R=0.999 1），表明通关藤苷A 浓度在 0.039 8 mg～0.139 4 mg内线性关系良好。

2.4 供试品溶液的制备

精密量取提取工艺制备的样品溶液100 μL，置于具塞试管中，挥干溶剂，按“2.3”项下方法操作，从标准曲线上读出供试品溶液中通关藤苷A的量，计算提取液中总皂苷的含量。结果见表3，表4。

表3 正交试验结果

表4 正交试验方差分析

通过直观分析得出：影响皂苷含量的因素依次为 A＞C＞B＞D，优选提取方案为 A2B2C3D3，即：乙醇浓度为70%、加醇量为10倍量、提取时间2 h、提取次数为4次。从直观分析结果可以看出，提取次数对总皂苷的含量影响甚微，提取3次和4次的差异不明显。因此，从能源节约角度选取提取3次作为最优工艺。

3 通关藤总皂苷纯化工艺研究

3.1 大孔树脂的筛选

采用动态吸附法，将浓度为5.55 mg/mL的通关藤提取物水溶液分别通过5种不同型号已经处理好的大孔吸附树脂柱（17.5 mL）进行动态吸附。由于测定的通关藤C21甾体皂苷在222 nm处有最大吸收，故紫外分光光度法在222 nm处检测流出液吸光度，待反应呈阳性时，表明已有甾体皂苷流出，树脂达到吸附饱和。停止上样，计算树脂的比吸附量。将吸附饱和的树脂先用蒸馏水洗脱至无色，弃去，再用乙醇洗脱，洗脱至留出液在222 nm处所测定的吸光度值满足要求，收集洗脱液，蒸干，称重，计算解析率。结果见表5。

从通关藤皂苷的吸附与解析看，AB-8和ZTC-1吸附量相当，但从解析率来看，差异较大；D3520和ZTC-1解析率相差不大，但如果要达到与ZTC-1相同的效果需要投入更多的树脂才能实现。因此综合考虑，初步分离纯化工艺研究宜采用ZTC-1大孔吸附树脂作为考察对象。

表5 动态吸附试验结果

3.2 ZTC-1大孔树脂洗脱曲线考察

量取已处理好的ZTC-1大孔吸附树脂50 g，装柱，取5.55 mg/mL的通关藤提取物水溶液上样70 mL，待上样结束后，依次用水，30%，40%，50%，60%，70%，80%，95%乙醇各100 mL进行洗脱，收集各部位洗脱液，浓缩置于10 mL量瓶中，取200 μL采用2.3项下方法于460 nm处记录样品吸光度，计算总皂苷含量，结果见表6。

表6 大孔树脂洗脱曲线

3.3 洗脱剂浓度对皂苷解析率的影响

量取已处理好的ZTC-1大孔吸附树脂50 g，装入玻璃层析柱，取1 g通关藤提取物溶于适量蒸馏水制成水溶液，上样，待上样结束后，用水100 mL洗去杂质，收集洗脱液，蒸干，按照2.3项下方法测定总皂苷含量。然后再依次用50%，70%，95%乙醇洗脱至流出液在222 nm处测定的吸光度值满足要求，收集洗脱液，蒸干，称重，再按照2.3项下方法测定总皂苷含量，结果见表7。

表7 洗脱剂浓度对皂苷解析率的影响

由表7可知，95%乙醇洗脱部位虽然增加了总皂苷的量，但相应代入的杂质增加多于皂苷。鉴于此，以水和50%乙醇用于洗脱杂质，收集50%～70%乙醇洗脱部位，以分光光度法计该部位的总皂苷含量高于70%。

3.4 洗脱剂用量的影响

量取已处理好的ZTC-1大孔吸附树脂50 g，装入玻璃层析柱，取5.55 mg/mL的通关藤提取物水溶液上样70 mL，分别以水和50%乙醇洗脱除去杂质，然后用70%乙醇200 mL洗脱，每2 mL为1个流分，收集洗脱液，于222 nm下测定吸光度值，以洗脱液容量作为横坐标，以测得的吸光度值作为纵坐标作图。结果见图1。

图1 洗脱剂用量的影响

由图1可知，当洗脱剂用量为100 mL时，样品的吸光度值趋近于零，说明此时树脂柱吸附的皂苷基本洗脱完全。因此，确定洗脱剂用量为1.5 BV。

4 MTT法检测通关藤总皂苷对细胞增殖的影响

取对数生长期的细胞，加入适量胰酶消化液，使贴壁细胞脱落，用15 mL含10%胎牛血清的DMEM培养基配置成细胞悬液，调整细胞浓度为1×105/mL，接种于 96 孔板，每孔 100 μL。用台盼蓝染色后在计数板上作细胞计数，不着色的活细胞在97%以上。将培养板移入CO2培养箱，在37℃，5%CO2条件下，继续培养24 h。将受试药物通关藤总皂苷和阳性对照药物顺铂注射液配置成高、中、低3个浓度，每孔加药10 μL，每个浓度3个复孔。将培养板移入CO2培养箱，在37℃，5%CO2条件下，继续培养48 h。同时与实验孔平行设置只加培养基的阴性对照孔和不加细胞，只加DMEM培养基的空白孔。孵育培养48 h后，用PBS小心清洗培养板，加入用DMEM培养基配置的1 mg/mLMTT溶液，在37℃，5%CO2条件下，继续培养4 h，使MTT还原。小心吸取孔内上清液，弃去，每孔加入 150 μL DMSO，震荡 10 min，使结晶物溶解。以空白孔调零，采用自动酶标仪在490 nm波长下检测各孔吸光度A值。按照下述公式计算抑制率：细胞增殖抑制率=［1-（A给药组-A空白孔）/（A阴性对照组-A空白孔）］×100%。以LOGIT法计算半数抑制浓度（IC50）。

通过实验发现，通关藤总皂苷对人肝癌细胞Hepg2具有抑制作用，高浓度组与空白对照比较差异具有统计学意义（P＜0.05），当提取物浓度大于0.312 mg/mL时，人肝癌细胞Hepg2的抑制率为48.2%，且随着药物剂量的增大其差异更为显著。通关藤总皂苷的IC50值为0.840 0 mg/mL。结果见表8、图2。

表8 不同受试物对人肝癌细胞Hepg2的抑制作用

图2 药物作用后观察细胞形态（×120）

5 讨论

由于通关藤提取物为70%乙醇提取所得，在用大孔树脂纯化时需要用水进行溶解，在此过程中会产生一定量的不溶物。因此本研究对加入水溶解的用量进行比较，明确了当加水量达到15倍后，水量增加于皂苷的溶解影响不大，且产生的不溶物中的皂苷含量最少，所以最终确定上样浓度为1 g通关藤提取物（相当于生药量为12.5 g）加入180 mL水进行溶解。

通过对5种大孔吸附树脂的吸附研究，发现ZTC-1型大孔吸附树脂较适合通关藤总皂苷的纯化，是一种比较理想的树脂，具有吸附量大、解吸率高、操作简便、重复性好、消耗少等优点，因此具有较好的推广应用前景。