黄芪总皂苷对CCl4 致小鼠急性肝损伤的保护作用

王 珏，李 琴，李 颖

（安徽中医药大学第一附属医院，安徽合肥230031）

肝损伤是临床常见病、多发病，多继发于慢性肝炎病毒感染、血吸虫感染、慢性酒精中毒、代谢性疾病及持续胆汁淤积等物理、化学、环境、药物因素引起的肝脏疾病，是形成脂肪肝、肝纤维化、肝硬化、肝腹水及肝癌的共同病理学基础［1-2］。黄芪总皂苷（Astragalosides，AST）是从中药黄芪中提取的主要有效部位群，研究发现，黄芪总皂苷具有抗应激、抗氧化、保护肝脏、抑制肿瘤和提高免疫调节等作用［3-4］。本实验以急性化学性肝损伤小鼠为模型，以黄芪总皂苷为干预手段，从肝功能、病理形态学以及相关蛋白表达等方面探讨黄芪总皂苷对急性化学性肝损伤小鼠的保护作用，为将其开发为安全、有效的抗肝损伤药物提供药理学实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 清洁级昆明小鼠，雄性，体质量（20±2）g，购自安徽医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK（皖）2011-002，每笼 5只，所有实验动物均饲养于安徽中医药大学第一附属医院实验动物中心。

1.1.2 实验药物 黄芪总皂苷（南京草本源生物科技有限责任公司，纯度≥98%），联苯双酯（万邦德制药集团股份有限公司，批号：A02J161134）。

1.1.3 试剂 CCl4（天津市富宇精细化工有限公司）；橄榄油（益海嘉里食品营销有限公司）；苏木素染液，伊红染液，珠海贝索生物技术有限公司；DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒，北京天根生化科技有限公司；SOD、MDA试剂盒，南京建成生物工程研究所。

1.1.4 仪器 3-18K型高速冷冻离心机，SIGMA公司；ZT-12M自动脱水机，YB-7B石蜡包埋机，孝感亚光医用电子技术有限公司；RM215病理切片机，上海徕卡仪器有限公司；病理图像成像系统（型号Image-Pro Plus）；正置荧光显微镜（Nikon 80i）；LDZ5-2型低速自动平衡离心机，北京京立离心机有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 分组、造模与给药 将60只小鼠随机分为正常组、模型组、联苯双酯组（150 mg/kg），黄芪总皂苷高、中、低剂量组（200 mg/kg、100 mg/kg、50 mg/kg），每组10只，正常组和模型组给予等量溶媒，每天1次，连续10 d。末次给药2 h后，除正常组外，每只小鼠腹腔注射10 mL/kg以橄榄油配制的5%CCl4溶液。

1.2.2 血清 MDA、SOD 含量检测 16～18 h 后，自小鼠后眼眶静脉丛采血，静置2 h后，3 500 r/min离心10 min，得到血清样本，按照试剂盒说明书对小鼠血清进行SOD、MDA含量的测定。

1.2.3 计算肝脏、脾脏指数 各组小鼠经眼球取血后，颈椎脱臼处死小鼠，迅速取出肝脏和脾脏，置于4℃生理盐水中洗去残血并除去表面结缔组织，滤纸吸净表面水分后称其质量，计算肝脏，脾脏指数。

1.2.4 HE染色观察肝组织病理形态学改变 将肝脏放置于10%中性甲醛溶液中固定，检测前从甲醛溶液中取出，做常规石蜡包埋，并进行苏木素-伊红（HE）染色，观察肝脏病理形态的改变。

1.2.5 免疫组化法检测肝组织中IL-1、TNF-α 的表达 取肝脏组织做常规脱蜡，水化，PBS缓冲液冲洗后，滴加抗原修复液，室温30 min，冲洗后滴加正常山羊血清封闭，滴加一抗，4℃孵育过夜后加二抗（IgG），并滴加DAB显色液进行显色，苏木素对细胞核进行复染后经二甲苯进行脱水，透明处理，封片，晾干后置于显微镜下观察。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 黄芪总皂苷对小鼠脏器指数的影响

与正常组比较，模型组小鼠肝脏指数显著增加（P＜0.01）；与模型组比较，黄芪总皂苷高、中剂量组及联苯双酯组肝脏指数、脾脏指数均存在不同程度的降低（P＜0.05 或 P＜0.01），各给药组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表1。

表1 黄芪总皂苷对小鼠脏器指数的影响 （±s）

表1 黄芪总皂苷对小鼠脏器指数的影响 （±s）

注：与正常组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.05，3）P＜0.01

组别 剂量（mg/kg） 肝脏指数（%） 脾脏指数（%）正常组 - 4.44±0.40 0.38±0.15模型组 - 5.35±0.531） 0.48±0.191）黄芪总皂苷低剂量组 50 4.99±0.692） 0.44±0.162）黄芪总皂苷中剂量组 100 4.80±0.412） 0.43±0.152）黄芪总皂苷高剂量组 200 4.62±0.373） 0.39±0.193）联苯双酯组 150 4.65±0.653） 0.42±0.163）

2.2 黄芪总皂苷对小鼠血清SOD、MDA含量的影响

与正常组比较，模型组小鼠SOD水平显著降低（P＜0.01），MDA 水平显著升高（P＜0.01），表明造模成功。与模型组比较，黄芪总皂苷各剂量组及联苯双酯组均能不同程度升高SOD水平，降低血清MDA 含量，且差异具有统计学意义（P＜0.01），结果见表2。

表2 黄芪总皂苷对小鼠血清SOD、MDA含量的影响（±s）

表2 黄芪总皂苷对小鼠血清SOD、MDA含量的影响（±s）

注：与正常组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.01

组别 剂量（mg/kg） SOD（U/L） MDA（μmol/L）正常组 - 204.80±9.37 17.03±1.35模型组 - 138.94±9.141） 72.55±6.171）黄芪总皂苷低剂量组 50 161.44±10.372） 55.73±9.242）黄芪总皂苷中剂量组 100 176.78±6.962） 42.02±4.912）黄芪总皂苷高剂量组 200 188.50±7.372） 33.08±4.592）联苯双酯组 150 181.25±4.532） 37.26±1.552）

2.3 黄芪总皂苷对小鼠肝脏组织病理形态的影响

正常组小鼠肝脏组织结构完整，细胞间排列整齐，分界清晰，肝小叶结构完整，形态规则，胞质均匀，细胞核清晰可见，无炎性细胞浸润现象。急性肝损伤模型组小鼠肝细胞形态紊乱，排列不规则，肝脏脂肪变性较明显，细胞体积较正常组明显增加，肝小叶结构不清晰，细胞出现肿胀和空泡现象，存在炎性细胞浸润。黄芪总皂苷组肝细胞间排列紧密，形态完整，肝小叶结构较清晰，空泡化现象较模型组显著改善。联苯双酯组肝脏细胞形态较稳定，未出现明显空泡化现象，肝小叶结构改善明显，肝索结构分布较正常，肝窦排列基本规则，细胞肿胀出现缓解，结果见图1。

图1 黄芪总皂苷对小鼠肝脏组织病理形态的影响（×200）

2.4 黄芪总皂苷对小鼠肝脏组织IL-1、TNF-α表达的影响

免疫组化结果表明：IL-1和TNF-α主要在细胞质中表达，且目标蛋白显示为棕黄色。与正常组比较，模型组小鼠肝脏组织中IL-1和TNF-α表达均明显增加；与模型组比较，黄芪总皂苷各剂量组均能不同程度降低小鼠肝脏组织中IL-1和TNF-α表达；联苯双酯组小鼠肝脏组织中IL-1和TNF-α表达亦明显降低。结果见图2、图3。

图2 黄芪总皂苷对小鼠肝脏组织IL-1蛋白表达的影响（×200）

图3 黄芪总皂苷对小鼠肝脏组织TNF-α蛋白表达的影响（×200）

3 讨论

本实验选用经典的CCl4诱导肝损伤模型，CCl4是一种肝毒性物质，也是目前诱导肝损伤的常用化学试剂［5］。CCl4进入血液后经过一系列酶促反应，生成多种自由基，其中有毒自由基可引起组织过氧化损伤［6-7］，引起肝细胞膜通透性的改变，引发一系列肝脏疾病的发生发展。

SOD是生物体内重要的抗氧化酶，其表达水平的高低反应了机体清除自由基能力的大小，SOD含量越高，表明清除体内自由基能力越强，抵抗炎症损伤及氧化应激反应越明显［8-9］。MDA是脂质过氧化反应的最终产物，MDA含量的高低反映了机体在受到自由基攻击时过氧化损伤程度的大小，其值越大，表明损伤越严重［10-11］。因此，测定血清样本中SOD和MDA的表达水平可以直接反应急性肝损伤对肝脏组织影响的程度。本实验中，肝损伤模型组SOD表达显著降低，MDA表达显著升高，表明肝细胞损伤较严重。而黄芪总皂苷组上述现象具有显著改善趋势，表明黄芪总皂苷具有保护肝细胞膜、清除自由基、降低肝脏损伤的能力。

TNF-α是一种单核因子，主要由单核细胞和巨噬细胞产生，在肝损伤过程中起着重要作用［12-13］。有研究表明，TNF-α的产生受NF-κB的调控，而其释放增加又促进NF-κB的磷酸化，使NF-κB激活，延续炎症反应的复杂环路调节，导致最初的炎症信号不断放大［14］。同时，TNF-α作为肝损伤的第一介质，它的出现将引起许多与肝坏死有关的第二介质，如 NO、IL-1、IL-6、IL-8、SIL-2R 等的产生，并且IL-1作为第二介质又有增强TNF-α的肝损伤作用，即使少量TNF-α存在，也会发生组织损伤现象［15-16］。本实验免疫组化结果显示，正常组小鼠中几乎不存在TNF-α和IL-1炎性因子的表达，急性肝损伤模型组中TNF-α和IL-1表达明显升高，给予黄芪总皂苷进行肝脏保护后，各给药组小鼠肝脏损伤程度呈现明显减轻状态，表明黄芪总皂苷对CCl4诱导的小鼠急性肝损伤存在改善作用，其机制可能与减少炎症因子释放有关。

综上所述，黄芪总皂苷对CCl4诱导小鼠肝损伤具有显著保护作用，其机制可能与清除体内自由基、减轻脂质过氧化程度、保护肝脏细胞活性、减少肝脏组织TNF-α和IL-1炎症因子的过度表达有关。