酵母硒对产蛋后期蛋鸡生产性能、蛋品质、抗氧化与脂代谢及其相关基因表达的影响

杨 玉 孙 煜 孙宝盛 朱 倩 张俊珍 高鹏飞

(山西农业大学动物科技学院，太谷 030801)

硒被认为是饲粮中必需的营养成分已有40余年。传统的补硒方法是在饲粮中添加亚硒酸钠作为硒源添加剂，但亚硒酸钠存在毒性强、使用不安全、生物利用率较低、环境污染大、具有氧化作用等问题，许多国家已规定饲料中禁止使用无机硒。有机硒在动物体内具有吸收率高、生物活性强、毒性低、环境污染小等特点[1]。缺硒可导致克山病、癌症、白内障、心血管与抑郁症等疾病发生，所以富硒鸡蛋已成为补硒的重要媒介。研究表明，添加富硒益生菌能显著提高蛋鸡的产蛋率、日产蛋量和蛋重，降低料蛋比，而添加无机硒对这些指标均无显著影响[2]。添加酵母硒和富硒苜蓿能显著提高罗曼蛋鸡的产蛋率，而添加亚硒酸钠对其产蛋率没有显著影响[3]，硒源和水平对蛋鸡血液硒含量、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和总抗氧化能力(T-AOC)有显著影响，有机硒较无机硒更易于沉积在鸡蛋、肝脏和肌肉等组织中[4-7]，显著提高鸡蛋中硒含量[8-10]和GSH-Px活性[11-12]。添加硒后，鸡蛋的哈氏单位(评价蛋新鲜度的重要指标之一)下降幅度降低，其中添加有机硒减缓哈氏单位下降的效果优于无机硒[2]。赵玉鑫[13]研究表明，饲粮中添加亚硒酸钠后，对蛋鸡血清胆固醇和甘油三酯含量无显著影响，但有降低趋势。王泽明[14]研究表明，饲粮中添加不同硒源对蛋鸡血浆胆固醇和甘油三酯含量无显著影响。而Attia等[9]研究表明，添加有机硒和无机硒及其互作可显著降低血浆胆固醇含量，增加蛋黄硒含量，其中以0.4 mg/kg有机硒组效果最佳。硒对鸡生产性能、抗氧化功能、血浆胆固醇含量等方面的研究已有报道，但其结果不一，分子机理方面的研究甚少。鉴于此，本试验通过在饲粮中添加不同水平的酵母硒，探讨其对产蛋后期蛋鸡生产性能、蛋品质、抗氧化与脂代谢及其相关基因表达的影响，并对其分子机理做初步探讨，旨在确定其适宜添加水平，为合理利用酵母硒、提高蛋硒含量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用酵母硒(selenium yeast，SY)购自奥特奇生物有限公司，硒含量2 000 mg/kg。

1.2 试验时间与地点

试验于2015年6月11日至2015年8月21日在山西省大同市大同县建鑫养殖场和山西农业大学动物遗传育种与动物营养省级重点实验室进行。

1.3 试验设计

试验选用69周龄、健康的海兰褐蛋鸡432只，随机分成4组，每组6个重复，每个重复18只。对照组饲喂基础饲粮(含0.2 mg/kg亚硒酸钠，以硒计)，试验组在基础饲粮的基础上分别添加0.2、0.6和1.0 mg/kg(以硒计)酵母硒。预试期2周，期间对照组与试验组的产蛋率和蛋重均无显著差异(P>0.05)，随后开始正式试验，正试期8周。基础饲粮组成及营养水平见表1。

1.4 饲养管理

试验鸡采用立体3层笼养，每笼3只，鸡只自由采食与饮水，自然光照并补充人工光照到16 h；温度(20±2) ℃，相对湿度50%～60%，自然通风结合纵向负压通风；其他均按养殖场常规程序进行。

1.5 样品采集与测定

1.5.1 生产性能

试验期间每日记录各重复的产蛋数、产蛋总重量，每7 d结料1次，记录各重复耗料重，计算平均日采食量，然后以重复为单位统计产蛋率、平均蛋重和料蛋比。

1.5.2 蛋品质

试验第14、28、42、56天，每个重复随机抽取3枚鸡蛋测定蛋重、蛋形指数、蛋壳强度、蛋白高度、哈氏单位、蛋黄颜色、蛋壳厚度，取其平均值。

1.5.3 血浆及组织相关指标

试验结束时每重复随机选取1只健康状况良好且体重接近的蛋鸡，空腹翅静脉采血5 mL，3 500 r/min离心10 min制备血浆，分装后于-20 ℃保存。随后颈静脉放血致死，采用无菌操作迅速取出肝脏放入液氮中，置于-80 ℃待测。按照相应试剂盒测定血浆GSH-Px活性、T-AOC、总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性与丙二醛(MDA)、胆固醇、甘油三酯含量以及肝脏GSH-Px活性与胆固醇和甘油三酯含量，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.5.4 蛋黄相关指标

试验结束时每重复选取2枚鸡蛋称重，破壳后分离蛋清和蛋黄，使用氢化物发生原子荧光分析方法测定蛋黄硒含量；使用相应试剂盒测定蛋黄胆固醇和甘油三酯含量，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

1)每千克维生素预混料含有Contained the following per kg of vitamin premix: 维生素A乙酸脂 retinol acetate 51 000 000 IU，VD313 500 000 IU，DL-α-生育酚乙酸酯DL-α-tocopheryl acetate 50 000 mg，VK35 000 mg，VB15 000 mg，VB225 000 mg，VB614 000 mg，VB1265 mg，叶酸 folic acid 4 000 mg，烟酰胺nicotinamide 90 000 mg，D-泛酸钙D-calcium pantothnate 32 000 mg，D-生物素D-biotin 100 mg。2)每千克微量元素预混料含有Contained the following per kg of trace mineral premix：Mn (as manganese sulfate) 60 g，Fe (as ferrous sulfate) 60 g，Cu (as copper sulfate) 8 g，Se (as sodium selenite) 100 mg，Zn (as zinc sulfate) 60g，I (as potassium iodide) 130 mg。3)计算值 Calculated values。

1.5.5 肝脏RNA提取和反转录

采用Trizol法提取肝脏组织RNA。用1%琼脂糖凝胶电泳、核酸蛋白仪测定RNA完整性、浓度和纯度。按照反转录试剂盒说明合成cDNA，-20 ℃保存备用。

1.5.6 引物设计

根据测序数据库中谷胱甘肽过氧化物酶1(GPx1)、胆固醇7α-羟化酶(Cyp7a1)、固醇调节元件结合酶1c(SREBP-1c)、硫氧还蛋白还原酶1(Trxr1)、3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGCR)基因的序列，设计其引物，由北京华大基因研究中心合成。引物序列见表2。

1.5.7 实时荧光定量PCR

1.6 数据处理与统计分析

采用SPSS 19.0统计软件对数据进行单因素方差分析。所有数据均以“平均值±标准差”表示，用Duncan氏法比较组间差异显著性，采用LSD法对差异显著的数据进行极显著差异比较，并对相应的数据进行线性和二次曲线回归分析。

2 结果与分析

2.1 饲粮中添加酵母硒对产蛋后期蛋鸡生产性能的影响

由表3可知，与对照组相比，饲粮中添加0.2、0.6和1.0 mg/kg的酵母硒显著提高了产蛋率(P<0.05)，并显著降低了料蛋比(P<0.05)，但对平均蛋重无显著影响(P>0.05)；饲粮中添加0.2 mg/kg的酵母硒显著增加了平均日采食量(P<0.05)。产蛋率、平均蛋重和平均日采食量各试验组之间均无显著差异(P>0.05)，但0.6 mg/kg组的料蛋比显著低于0.2和1.0 mg/kg组(P<0.05)。

表2 引物序列

表3 饲粮中添加酵母硒对产蛋后期蛋鸡生产性能的影响

(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05)。表5、表6和表7同。In the same column, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01), while with no or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as Table 5, Table 6 and Table 7.

2.2 饲粮中添加酵母硒对产蛋后期蛋鸡蛋品质的影响

由表4可知，与对照相比，饲粮中添加1.0 mg/kg的酵母硒显著提高了第14天的蛋白高度(P<0.05)；饲粮中添加0.2 mg/kg的酵母硒显著增加了第14天的蛋黄颜色(P<0.05)；饲粮中添加0.6 mg/kg的酵母硒极显著提高了第42天的蛋壳强度(P<0.01)，添加1.0 mg/kg的酵母硒显著提高了第42天的蛋壳强度(P<0.05)；饲粮中添加0.6和1.0 mg/kg的酵母硒显著增加了第42天的蛋壳厚度(P<0.05)。随着饲粮中酵母硒添加量的增加，蛋黄硒含量极显著提高(P<0.01)。

2.3 饲粮中添加酵母硒对产蛋后期蛋鸡抗氧化指标的影响

由表5可知,与对照组相比，饲粮中添加0.2 mg/kg的酵母硒极显著提高了血浆T-SOD活性(P<0.01)，显著降低了血浆MDA含量(P<0.05)，而对血浆GSH-Px活性、T-AOC及肝脏GSH-Px活性无显著影响(P>0.05)；饲粮中添加0.6 mg/kg的酵母硒极显著提高了血浆GSH-Px、T-SOD活性和T-AOC及肝脏GSH-Px活性(P<0.01)，显著降低了血浆MDA含量(P<0.05)；饲粮中添加1.0 mg/kg的酵母硒极显著提高了血浆GSH-Px、T-SOD及肝脏GSH-Px活性(P<0.01)，显著提高了血浆T-AOC (P<0.05)，并极显著降低了MDA的含量(P<0.01)。

表4 饲粮中添加酵母硒对产蛋后期蛋鸡蛋品质的影响

同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05)。In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01), while with no or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).

表5 饲粮中添加酵母硒对产蛋后期蛋鸡抗氧化指标的影响

2.4 饲粮中添加酵母硒对产蛋后期蛋鸡脂代谢指标的影响

由表6可知，与对照组相比，饲粮中添加0.2、0.6和1.0 mg/kg的酵母硒对血浆胆固醇和甘油三酯含量均无显著影响(P> 0.05)；饲粮中添加1.0 mg/kg的酵母硒极显著降低了肝脏甘油三酯含量(P<0.01)，显著降低了肝脏胆固醇含量(P<0.05)；饲粮中添加0.6 mg/kg的酵母硒显著降低了肝脏胆固醇含量(P<0.05)；饲粮中添加 0.2 mg/kg的酵母硒对肝脏胆固醇和甘油三酯含量均无显著影响(P> 0.05)；饲粮中添加0.6、1.0 mg/kg的酵母硒显著降低了蛋黄甘油三酯含量(P<0.05)，而对蛋黄胆固醇含量无显著影响(P>0.05)。3个试验组间，0.6和1.0 mg/kg组的肝脏胆固醇和蛋黄甘油三酯含量均显著低于0.2 mg/kg(P<0.05)，且1.0 mg/kg组的甘油三酯含量还极显著低于0.2和0.6 mg/kg组(P<0.01)。

表6 饲粮中添加酵母硒对产蛋后期蛋鸡脂代谢指标的影响

2.5 饲粮中添加酵母硒对产蛋后期蛋鸡肝脏抗氧化、脂代谢相关基因mRNA相对表达量的影响

由表7可知，与对照组相比，饲粮中添加0.6 mg/kg的酵母硒极显著提高了肝脏GPx1、Trxr1、SREBP-1cmRNA的相对表达量(P<0.01)，极显著降低了HMGCRmRNA的相对表达量(P<0.01)，而对Cyp7a1 mRNA的相对表达量无显著影响(P>0.05)。

表7 饲粮中添加酵母硒对产蛋后期蛋鸡肝脏抗氧化、脂代谢相关基因mRNA相对表达量的影响

2.6 模型估测产蛋后期蛋鸡对酵母硒的需要量

回归分析表明，蛋黄硒含量、血浆GSH-Px活性、T-AOC、T-SOD活性、MDA含量及肝脏GSH-Px活性均随酵母硒添加量的增加呈显著的二次曲线变化(表8)。就生产性能而言，酵母硒的适宜添加量为0.60～0.65 mg/kg；就蛋黄硒含量而言，酵母硒的适宜添加量为2.25 mg/kg；就血浆GSH-Px活性、T-AOC、T-SOD活性及肝脏GSH-Px活性而言，酵母硒的适宜添加量为0.67～0.77 mg/kg。

3 讨 论

3.1 饲粮中添加酵母硒对产蛋后期蛋鸡生产性能的影响

有关硒对蛋鸡生产性能的研究结果各异。胡华锋等[3]研究发现，添加酵母硒和富硒苜蓿能显著提高罗曼蛋鸡的产蛋率，而添加亚硒酸钠对其产蛋率没有显著影响；Gjorgovska等[15]研究表明，饲粮中添加酵母硒能改善蛋鸡的生产性能；Pavlovic等[16]发现酵母硒可以使蛋鸡的产蛋量显著提高；而孙庆艳等[11]和Delezie等[17]研究表明，添加不同的硒源和硒水平对蛋鸡的生产性能并无显著影响。本试验结果表明，饲粮中添加不同水平酵母硒后产蛋率均显著升高，料蛋比均显著降低，与Gjorgovska等[16]选用80周龄蛋鸡所得结果一致，说明添加酵母硒可改善产蛋后期蛋鸡机体的硒代谢，影响促性腺激素释放，提高产蛋率。

表8 蛋鸡相关指标与酵母硒需要量的回归模型

3.2 饲粮中添加酵母硒对产蛋后期蛋鸡蛋品质的影响

蛋品质主要通过蛋壳厚度、蛋壳强度、蛋形指数、蛋白高度、哈氏单位和蛋黄颜色等指标来综合判断。蛋壳强度和蛋壳厚度直接影响鸡蛋的破损率，哈氏单位直接反映鸡蛋新鲜程度及蛋白品质。

研究表明，饲粮中添加酵母硒对蛋壳厚度的影响不显著[18]；夏季在饲粮中添加酵母硒，蛋壳厚度、蛋白高度和哈氏单位均显著提高[19]；添加酵母硒可提高蛋壳重与蛋壳强度[20]。而Pavlovic等[16]研究表明，饲粮中添加酵母硒对蛋壳品质、蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋形指数均无显著影响。本试验结果显示，饲粮中添加0.6 mg/kg的酵母硒可显著提高6周末的蛋壳强度和蛋壳厚度，与Invernizzi等[20]所得结果一致。其原因可能是蛋鸡采食酵母硒后体内硒易沉积于蛋壳膜和蛋壳中，具体机理有待进一步研究。

3.3 饲粮中添加酵母硒对产蛋后期蛋鸡蛋黄硒、胆固醇和甘油三酯含量的影响

Han等[12]研究发现，与对照组相比，补硒显著提高了蛋中硒的含量。Bennett等[21]也发现，在饲粮硒添加量在一定范围内时，蛋硒含量会随硒添加量的增加而增加，其中有机硒效果优于无机硒。Paton[22]得出饲粮硒含量与蛋硒含量基本呈正相关。本试验中蛋黄硒含量随饲粮中酵母硒添加量的增加而增加，所得结果与Paton[22]的研究结果相符。

关于酵母硒对蛋黄胆固醇和甘油三酯含量影响的研究较少。本试验中，饲粮中添加酵母硒有降低蛋黄胆固醇含量的趋势，但效果不显著；饲粮中添加0.6、1.0 mg/kg的酵母硒可显著降低蛋黄甘油三酯含量，这与李静等[23]的研究结果不符。李静等[23]研究发现，饲粮中添加酵母硒能降低蛋鸡蛋黄中胆固醇含量，其主要原因可能是升高了蛋鸡血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量，降低了极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)含量所致，具体机制有待进一步研究。

3.4 饲粮中添加酵母硒对产蛋后期蛋鸡抗氧化及其相关基因表达的影响

GSH-Px和T-SOD作为机体抗氧化体系的重要酶，在抗氧化过程中发挥重要作用。其中GSH-Px的活性中心为硒代半胱氨酸，由4个含硒代半胱氨酸亚基组成，所以机体硒水平直接反映GSH-Px活性。研究表明，饲粮中添加硒可显著提高母鸡血清GSH-Px活性[12]；饲粮中添加0.3 mg/kg酵母硒可显著提高肉鹅血清中GSH-Px和T-SOD活性，同时MDA含量显著降低[24]；在饲粮中添加利用啤酒废酵母制备得到的酵母硒，肉鸡肝脏GSH-Px活性可随酵母硒添加量的增加而升高[25]。本试验发现，饲粮中添加适量的酵母硒可显著或极显著提高蛋鸡血浆GSH-Px、SOD活性，T-AOC与肝脏GSH-Px活性，并显著或极显著降低血浆MDA含量，与上述研究结论相符，且随着酵母硒添加量的增加抗氧化性能呈先上升后下降的趋势，以添加0.6 mg/kg酵母硒时血浆GSH-Px、T-SOD活性，T-AOC和肝脏GSH-Px活性达到峰值。虽然在添加1.0 mg/kg酵母硒时较添加0.6 mg/kg酵母硒时抗氧化性能整体有所降低，但与对照组相比，1.0 mg/kg组上述指标仍显著或极显著高于对照组，说明酵母硒添加量在1.0 mg/kg范围内均可提高机体抗氧化性能，但以添加0.6 mg/kg酵母硒时最好。

现已发现，在GSH-Px中，GPx-1在肝脏中活性最高，是细胞中含量最丰富的硒蛋白；Trxr1也是衡量机体抗氧化功能的重要指标之一，其活性也主要受机体硒含量的影响，但饲粮中添加硒源及硒水平对GPx1和Trxr1表达量的影响说法不一。为了进一步探讨酵母硒抗氧化的分子机制，本试验测定了饲粮中添加0.6 mg/kg酵母硒对蛋鸡肝脏GPx1和Trxr1 mRNA相对表达量的影响，结果发现饲粮中添加0.6 mg/kg可极显著提高蛋鸡肝脏GPx1和Trxr1 mRNA的相对表达量。高建忠[26]在仔猪饲粮中添加亚硒酸钠和富硒益生菌后发现，二者对仔猪肝脏GPx1 mRNA相对表达量的影响不显著；缺硒可造成大鼠肝脏GPx1 mRNA相对表达量降低，补硒可提高大鼠肝脏GPx1 mRNA相对表达量[27]。Lu等[28]的研究表明，随着机体硒含量的升高，Trxr1和Trxr2蛋白表达量增加，缺硒使大鼠肝脏Trxr1 mRNA表达量下降为正常大鼠的15%，而GSH-PxmRNA表达量仅下降了正常大鼠的2%，而本试验在正常饲粮中添加0.6 mg/kg酵母硒，蛋鸡肝脏Trxr1 mRNA相对表达量的提高幅度也高于GPx1 mRNA，说明Trxr1 mRNA受硒状态调节幅度高于GPx1 mRNA[29]。

3.5 饲粮中添加酵母硒对产蛋后期蛋鸡脂代谢的影响

肝脏是合成蛋鸡体内胆固醇的主要器官，当体内胆固醇含量较高时，SREBP-1c可促进脂肪酸生成并与胆固醇合成胆固醇酯，从而消耗胆固醇[30]，而HMGCR是胆固醇合成过程中的限速酶[31-33]。

关于硒对蛋鸡血液、肝脏胆固醇和甘油三酯含量影响的研究很少，赵玉鑫[12]研究表明，饲粮中添加亚硒酸钠后蛋鸡血清胆固醇和甘油三酯含量与对照组相比差异不显著，但有降低趋势。李静等[23]研究发现，饲粮中添加0.5 mg/kg富硒酵母对蛋鸡血清胆固醇和甘油三酯含量的影响不显著。王泽明[14]也指出，饲粮中添加不同硒源对蛋鸡血浆胆固醇和甘油三酯含量无显著影响。本试验结果表明，饲粮中添加酵母硒对蛋鸡血浆胆固醇和甘油三酯含量无显著影响，与上述研究结果一致。但饲粮中添加0.6 和1.0 mg/kg酵母硒可显著降低蛋鸡肝脏胆固醇含量，添加1.0 mg/kg酵母硒可极显著降低蛋鸡肝脏甘油三酯含量，添加0.6 mg/kg酵母硒可极显著提高肝脏SREBP-1cmRNA相对表达量，极显著降低蛋鸡肝脏HMGCRmRNA相对表达量，这与肝脏胆固醇和甘油三酯含量减少的结果相吻合，可见酵母硒可通过影响SREBP-1c和HMGCRmRNA的表达来影响机体脂代谢。

4 结 论

饲粮中添加酵母硒可提高产蛋后期蛋鸡的生产性能、蛋壳强度、蛋黄硒含量，改善机体抗氧化性能和胆固醇代谢能力。通过回归分析得出，以饲粮(含0.20 mg/kg亚硒酸钠形式的硒)中添加0.60～0.77 mg/kg酵母硒的效果较好。