miRNA对Fontan术后血小板活化程度及血栓形成影响的精确预测价值

(上海交通大学医学院，上海 200092 1 附属新华医院儿心血管科； 2 附属上海儿童医学中心心脏中心)

临床一些复杂性先天性心脏病，如三尖瓣闭锁、单心室、肺动脉闭锁伴室间隔完整等病儿多数需行Fontan手术以降低死亡率。Fontan手术是将上、下腔静脉直接连接到肺动脉，从而使肺循环和体循环分开，该手术虽然一定程度能够减轻病儿低氧状况，但术后一些常见并发症，如心律失常、血栓栓塞、腔静脉压力升高及心力衰竭等可能会致病儿死亡[1]。由于腔静脉血直接回流肺动脉，使肺动脉缺少“脉冲性”血流灌注，可造成术后肺动脉狭窄、扭曲，肺血栓和肺动脉高压形成，且随生存时间延长而日益明显。多项临床研究表明，Fontan术后血栓栓塞是造成病人死亡的重要原因。Fontan术后血栓形成常见原因有血管内皮受损、血管狭窄、凝血功能异常等。临床研究发现一些微小核糖核酸(miRNA)与血管内皮损伤和血小板活化、血栓形成等有关。血管内皮损伤以后miR-126以及miR-21常升高，而miR-96、miR-340以及miR-223升高则提示血小板活化[2]。本研究主要探讨外周血白细胞、血小板以及血清中miRNA变化能否准确预测单心室病儿行Fontan术后对血小板活化以及血栓形成的影响，旨在为临床随访及抗血栓治疗提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验对象

单心室行Fontan术后病儿6例(TG组)，男4例，女2例；年龄2～11岁，平均5.6岁；术后时间为1～5年。体检正常的儿童6例(CG组)，男3例，女3例；年龄2～12岁，平均6.2岁。试验前收集血液标本均告知家长并签署知情同意书。

1.2 主要仪器和试剂

CO2细胞培养箱(Thermo Scientific，Waltham，美国)；倒置显微镜(Olympus，Tokyo，日本)；电泳仪和电转仪(BIO-RAD，Irvine，美国)；Real-time检测仪(天龙，TL988)。Ficoll(GE，17-5442-02,美国)；TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit等试剂盒(Takara，日本)；Ikkb Antibody等抗体(Affinity，AF6009，美国)；RIPA组织细胞快速裂解液(Solarbio，R0010)；BCA蛋白定量试剂盒(Thermos，PICPI23223，美国)等。

1.3 实验方法

1.3.1血清、血小板和白细胞中miRNA提取 采集病儿静脉血15 mL,分别用于血清、血小板和白细胞中miRNA提取。①血清miRNA提取：将其中的5 mL静脉血置于干管中，30 min内高速离心(3 000 r/min离心10 min，后8 000 r/min离心15 min)分离血清。加入QIAzol试剂使血清变性，然后用Qiagen miRNeasy Mini Kit进行RNA采集和纯化。②血小板miRNA提取：将其中5 mL静脉血置于抗凝管中，4 ℃静止过夜收集上清液。采用DEPC水稀释血清，然后12 000 r/min低温离心10 min，收集血小板，用于提取miRNA。③白细胞miRNA提取：将其中5 mL静脉血以淋巴分离液Ficoll分离出单个核细胞，用于提取miRNA。

1.3.2实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测不同标本中miRNA的表达 常规配置反应液，反转录反应条件如下:37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 5 min。各引物如下：内参照U6正义链：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反义链：5′-AACGCTTCACGAA-TTTGCGT-3′；miR-223正义链：5′-TGCGGCCGTGTATTTGACAA-3′，反义链：5′-CCAGTCTCAG-GGTCCGAGGTATTC-3′；miR-150正义链：5′-TG-CGGCCGTGTATTTGACAA-3′，反义链：5′-TGCG-GCTCTCCCAACCCTTGTA-3′；miR-126正义链：5′-TGCGGCCGTGTATTTGACAA-3′，反义链：5′-TGCGGCCATTATTACTTTT-3′；miR-21正义链：5′-TGCGGCCGTGTATTTGACAA-3′，反义链5′-TGCGGCTAGCTTATCAGACT-3′；miR-197正义链：5′-TGCGGCCGTGTATTTGACAA-3′，反义链：5′-TGCGGCTTCACCACCTTCTCCA-3′。点好样的PCR板放置于Real time PCR仪上进行PCR反应，95 ℃预变性30 s；然后95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，共进行40个循环；循环结束后进行熔解曲线分析，通过检测Ct值，定量分析样本中miRNA的表达量。

1.3.3流式细胞仪检测外周血血小板活化水平以抗凝管采集CG和TG组儿童外周静脉血5 mL，室温下1 000 r/min离心10 min，上层淡黄色液体即为富血小板血浆(PRP)。缓慢吸出PRP置于新的离心管中，继续室温下4 000 r/min离心10 min后弃去上清液，所剩的部分为血小板沉淀。用含有1 g/L BSA和0.01 mol/L EDTA的PBS(0.01 mol/L)1 mL冲洗血小板沉淀，室温下离心4 000 r/min离心10 min后再次弃去上清，重复3次，以此提纯血小板沉淀。提纯的血小板加入PBS 190 μL，混匀后均分成两份，分别加入5 μL CD41a-PE抗体和5 μL CD62p-PE抗体，涡旋混匀；4 ℃孵育30 min；加入10倍体积的PBS，洗涤2次，流式细胞仪分选收集CD41a、CD62p阳性的细胞。

1.3.4Western Blot检测白细胞内抑制miR-223表达对Iκb和p-p65及NF-κB蛋白的影响 采集TG组和CG组抗凝外周血，将插入miR-223转录抑制因子的慢病毒转染各组的外周血白细胞，分为CG+病毒无转录抑制因子组(CC组)，TG+病毒无转录抑制因子组(TC组)，CG+病毒含转录抑制因子组(CI组)和TG+病毒含转录抑制因子组(TI组)。观察当miR-223表达抑制后，对白细胞NF-κB信号路径中IKKb、Iκb以及NF-κB表达的影响。步骤如下。①蛋白收集：经慢病毒转染72 h后收集各组细胞，2 000 r/min离心10 min，弃上清液；PBS洗涤；加入RIPA裂解液裂解，离心后取上清液；②Western Blot检测：将含有蛋白质样品加入缓冲液，进行垂直平板凝胶电泳，在电泳结束前，铺PVCF膜，放入电转仪中，加入转膜缓冲液，转膜1 h；取膜以后以10 g/L的BSA室温封闭2 h；然后分别加入TBST稀释的一抗IKKb(1∶2 000)、Iκb(1∶2 000)、NF-κB(1∶3 000)、p-p65(1∶2 000)以及β-actin(1∶5 000)4 ℃孵育过夜。HRP标记的二抗(1∶5 000)室温孵育1 h；加入化学发光试剂，至出现显影条带，取出包好PVDF膜，于暗室中用X胶片感光、显影、定影，然后用图像显影仪进行分析，测平均灰度值。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 两组miRNA表达比较

两组miR-126、miR-223表达水平比较，差异有显著性(t=3.22、3.45，P<0.05)。见表1。

表1 两组病人血清中miRNA表达水平比较(n=6,±s)

表1 两组病人血清中miRNA表达水平比较(n=6,±s)

分组miR21miR126miR150miR197miR223CG组1.183±0.6181.055±0.3301.107±0.5301.097±0.4371.028±0.245TG组2.028±1.0640.507±0.2560.718±0.4060.727±0.2921.718±0.424

2.2 两组血小板活化情况比较

实验结果显示，CG组CD62p、CD41a表达率分别为(4.6±1.2)%、(2.6±0.3)%，而TG组血小板中CD62p、CD41a的表达率分别为(12.3±1.8)%、(18.4±2.5)%，两组比较，差异有显著性(t=17.57、87.54，P<0.01)。

2.3 qRT-PCR检测外周血血小板和白细胞中miR-223表达水平

以CG组外周血血小板或白细胞中miR-223相对表达水平为1，TG组外周血血小板中miR-223表达水平为6.2±0.52，而外周血白细胞中miR-223表达水平为5.4±0.56，两组比较，差异具有统计学意义(t=5.62、4.32，P<0.05)。

2.4 含miR-223抑制因子的慢病毒转染正常人白细胞对miR-223表达的影响

以CC组白细胞中miR-223相对表达水平为1，CI组白细胞中miR-223表达水平为0.36±0.04，两组比较，差异有显著性(t=45.30，P<0.01)。

2.5 白细胞内miR-223表达抑制后对Iκb和p-p65及NF-κB表达的影响

与CC组比较，TC组白细胞中Iκb蛋白表达下调，p-p65蛋白表达上调，CI组白细胞中Iκb蛋白表达上调，p-p65蛋白表达下调；与CI组比较，TI组白细胞中Iκb蛋白表达下调，p-p65蛋白表达上调。Ikkb和NF-κB蛋白表达在不同处理组间无明显变化。见图1。

①CC组；②TC组；③CI组；④TI组。

3 讨 论

Fontan术后血栓栓塞是病儿重要的死亡原因之一，主要和血管内皮受损、血管平滑肌增生和血小板活化等有关[3-5]。由于部分血栓栓塞无明显临床症状，故其真实发生率难以估计[6-7]。MONAGLE等[8]分析了多中心资料估测发生率为3%～16%，KHAIRY等[9]分析波士顿儿童医院261例病例发现，Fontan术后因血栓导致的死亡10年时为1%～3%，25年时则高达9%～12%。并发现术后未应用抗凝或抗血小板治疗是血栓栓塞性死亡的独立危险因素。

最近研究显示，miRNA可作为血管损伤的标志物，miRNA是高度保守的短链核糖核酸，广泛参与调控基因表达[10-11]，其中miR-126、miR-21、miR-663与血管内皮损伤有关[12-13]；miR-153、miR-145/143、miR-223等可反映血管内皮增生的情况[14-15]，在血管狭窄的过程中胰岛素样生长因子1受体(ILGF1R)使血管平滑肌细胞增生，此时miR-223以及miR-153表达下调[16]。LAFFONT等[17]发现miR-223在血小板活化过程中高表达，可以作为凝血因子激活的指标。

本研究结果显示，TG组病儿血清中miR-223表达水平较CG组明显升高，当其升高时，血小板活化率也同时增强。血小板活化后，可释放一些凝血因子如ADP、血栓素等，可促进血栓的形成[18]。此外，血小板中还含有丰富的miRNA[19]，进一步研究发现TG组病儿血小板和白细胞中miR-223表达增多，此时白细胞中NF-κB信号途径中的Iκb蛋白表达下调，p-p65蛋白表达上调，通过慢病毒转染抑制白细胞中miR-223的表达，CI组表现为Iκb蛋白表达上调，p-p65蛋白表达下调，但TI组与之相比，表现为Iκb蛋白表达下调，p-p65蛋白表达上调，说明白细胞中miR-223抑制后Iκb蛋白表达上调，p-p65蛋白表达下调。因此推测单心室行Fontan术后病儿白细胞中miR-223高于正常人，可造成Iκb蛋白表达水平降低而p-p65蛋白表达水平升高，继而激活NF-κB信号通路，导致进一步病理生理改变。

NF-κB蛋白家族是一种多效性的转录因子，可以与多种基因启动子部位的κb位点发生特异性结合从而促进其转录表达。NF-κB为p50/p65异源二聚体，Iκbα和Iκbβ主要与含有p65和Rel的二聚体具有高亲和力，是体内NF-κB(p50-p65)的主要调控抑制蛋白。当细胞受到各种内外刺激后，Iκb激酶被激活，从而导致Iκb蛋白磷酸化、泛素化，然后Iκb蛋白被降解，使NF-κB二聚体得到释放。释放后的NF-κB二聚体通过各种翻译后的修饰作用而被进一步激活，并转移到细胞核中。在细胞核里与目的基因结合，促进目的基因的转录[20-21]。Fontan术后病儿外周血白细胞中Iκb降低，使白细胞内NF-κB活化，其活化后通过ICAM-1、VCAM-1与白细胞表面的配体相应地结合，介导白细胞贴壁黏附、聚集、浸润，导致局部炎症发生，从而使微血管内皮细胞损伤[22-23]。此外，NF-κB活化可促进血管性血友病因子(vWF)的表达。vWF是Ⅷ因子的相关因子，与Ⅷ因子结合，能有效防止Ⅷ因子在血浆中迅速降解。vWF与Ⅷ因子结合，组成FⅧ/vWF，一端与血小板糖蛋白Ib结合，另一端与内皮细胞下的胶原纤维连接，介导血小板黏附血管内皮，促进微血栓形成[24-25]。本实验结果显示，Fontan术后血流动力学改变可能激活Iκb激酶，从而使Iκb蛋白被降解，继发引起NF-κB活化，造成血管内皮损伤和微血栓形成，这可能是Fontan术后血栓形成较重要的原因。

但NF-κB活化后，如何调节细胞核基因的转录并对血栓形成造成影响，其具体机制本研究未涉及，未来尚需进一步深入研究探讨。