促排卵过程中累积促性腺激素使用量对后续冻融胚胎移植周期妊娠结局的影响

刘闯，马媛，海溧，李博，曹泽磊，马夜肥，康彬，李丽，王晓红

(空军军医大学唐都医院妇产科生殖医学中心，西安 710038)

促排卵(COH)是体外受精-胚胎移植技术的关键步骤之一，其目的是在一个治疗周期内获得多于自然生理过程的卵母细胞数，进而提高累计妊娠率。促性腺激素(Gn)用量的增大可以提高获卵数，提高累积妊娠率，但是种植率和活产率下降，并且会增加卵巢过度刺激综合征的发生风险[1-2]。有研究表明，高剂量Gn的使用可能通过影响卵母细胞及胚胎质量和子宫内膜容受性[2-5]进而影响新鲜周期的临床结局。然而，在冻融胚胎移植(FET)周期中，虽然避免了Gn对子宫内膜的影响，但是既往促排过程中高Gn用量对胚胎产生的影响是否对会影响FET临床结局，目前尚不明确，因此，本研究回顾性分析我院2016年10月1日至2017年11月30日FET周期的患者临床资料，探讨Gn累积使用量对后续FET周期临床结局影响，以期能为辅助生殖技术临床工作提供参考。

资料与方法

一、研究对象与分组

1.研究对象：回顾性分析我院妇产科生殖医学中心2016年10月1日至2017年11月30日行FET周期的患者临床资料，最终符合研究条件的治疗周期共1 923个(1 856名患者)。

纳入标准：(1)取卵次数≤2次；(2)胚胎移植次数≤2，且移植胚胎中至少有一个好的或者中等胚胎。排除标准：(1)因各种因素行胚胎种植前遗传学诊断/筛查(PGD/PGS)助孕；(2)男方精子畸形率≥99%；(3)移植方式为双移植；(4)促排卵方案为自然周期或微刺激周期；(5)宫腔粘连或子宫畸形患者；(6)失访或数据缺失。

2.分组：促排卵过程中使用Gn药物主要有果纳芬(75 U/450 U，默克，瑞士)、普利康(100 U/600 U，默沙东，美国)和丽申宝(75 U，丽珠)，为了便于计算，在临床工作中将使用量统一折合为75 U/支。根据FET患者人数以及在促排卵周期累积Gn使用量，将研究对象平均分为3组，A组：低剂量组，共572周期，Gn使用量(14.9±2.9)支(3～19支)；B：中等剂量组，共660周期，Gn使用量(24.5±3.2)(20～30支)；C组：高剂量组，共691周期，Gn使用量(44.7±12.9)(31～97支)。

二、治疗过程

1.促排卵：促排卵方案为长方案和拮抗剂方案，所用方法同既往研究[6]。当主导卵泡直径 ≥18 mm时，或至少有3枚卵泡直径≥17 mm时，根据雌激素水平选择肌注人绒毛膜促性腺激素(HCG，珠海丽珠)5 000～10 000 U/艾泽(默克雪兰诺，意大利)250 μg，34～36 h后B 超引导下行经阴道穿刺取卵手术[7]。

2.体外受精-胚胎培养：根据病史和检测结果，采用IVF/ICSI技术行体外受精，受精后16～18 h评估受精结果，并将正常受精的合子在胚胎培养箱(COOK)内继续培养3～6 d。

3.胚胎评估：D3和D5胚胎评估根据中华医学会生殖医学分会实验室学组共识[8]和Istanbul共识[9]，根据胚胎细胞数目、碎片、囊胚的内细胞团和外滋养层细胞将胚胎质量分为三个级别，即优质胚胎、中等质量胚胎和差等胚胎。

4.胚胎冻融：采用玻璃化方法将胚胎冷冻保存，所用冷冻及解冻试剂、Crytop栽杆均来自Kitazato(日本)，具体方法如下[10]：(1)胚胎冷冻：将胚胎/囊胚从培养液CM/BM(COOK，美国)中转移至平衡液ES中，室温下静置5 min，随后转入玻璃化冷冻液VS中，60 s以内将胚胎转移到做好标记的载杆上，迅速投入液氮中并盖帽保存；(2)胚胎解冻：从液氮中取出栽杆，迅速将装有胚胎的叶片前端分别置于 TS 液中1 min，DS液3 min，WS1液5 min，WS2液5 min(置于37℃热板上)，最后转移至BM液中培养。

5.冻融周期胚胎移植：排卵正常者一般选择自然周期移植；排卵异常者则采用激素替代周期或使小剂量促性腺激素进行内膜准备。胚胎解冻后存活，则在B超引导下行胚胎移植术，同时进行黄体支持。胚胎移植后15 d检测血HCG，若HCG阳性，则判断为生化妊娠，胚胎移植4周后行超声检查，可见胎心搏动者为临床妊娠。

6.变量收集及观察指标：

(1)记录患者年龄、体重指数(BMI)、基础卵泡刺激素(FSH)、基础抗苗勒氏管激素(AMH)、基础窦卵泡数、不孕年限、不孕类型、不孕因素、新鲜周期所用促排卵方案及受精方式，冻融周期胚胎移植当日子宫内膜厚度、冻融周期胚胎移植当日子宫内膜厚度及形态、冻融周期移植胚胎的形态及胚胎质量。

(2)观察指标：以下指标概念参考2009年监测辅助生殖技术国际委员会和世界卫生组织修订辅助生殖技术术语词汇表[11]，着床率=着床胚胎数/移植胚胎数×100%；临床妊娠率=临床妊娠例数/总移植周期数×100%；异位妊娠率=异位妊娠例数/临床妊娠例数×100%；流产率=流产例数/临床妊娠例数×100%；持续妊娠率=目前随访中妊娠仍顺利进行的患者/临床妊娠例数×100%。

三、统计学分析

结 果

一、一般资料比较

本研究共纳入1 923个FET周期，比较分析3组间患者的一般资料，结果发现A组与B组相比，女方年龄、BMI、基础FSH和AMH水平均存在统计学差异(P<0.05)；A组与C组相比，女方年龄、BMI及基础FSH、AMH、AFC、不孕类型以及不孕因素中的男方因素和双方因素之间均存在统计学差异(P<0.05)；B组和C组相比，女方年龄、BMI、基础FSH、AMH、不孕年限、不孕类型、不孕因素中的男方因素和双方因素之间存在统计学差异(P<0.05)(表1)。

表1 患者一般情况比较[(-±s)，n(%)]

注：与A组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05

二、促排卵周期中基础临床数据比较

在促排卵过程中，3组间的Gn天数和获卵数相比较，均有统计学差异(P<0.05)，而3组受精方式相比，均无统计学差异(P>0.05)；A组的促排卵方案与B、C两组比较，均有显著性差异(P<0.05)；B组与C组相比，短效长方案和长效长方案之间均有显著性差异(P<0.05)，而两组间的拮抗剂方案无统计学差异(P>0.05)(表2)。

表2 促排卵周期中基础临床数据比较[(-±s)，n(%)]

注：与A组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05

三、FET周期中基础临床数据的比较

FET周期中，3组患者的胚胎移植日内膜形态、移植胚胎数、子宫内膜厚度及形态比较均无统计学差异(P>0.05)；A组与B组相比，移植胚胎质量中的优质胚胎和中等胚胎差异均有统计学意义(P<0.05)；A组与C组相比，胚胎类型、移植胚胎质量中的优质胚胎和中等胚胎均有统计学差异(P<0.05)；B组和C组相比，胚胎类型、移植胚胎质量均无统计学差异(P>0.05)(表3)。

四、FET周期中Gn用量与妊娠结局的单因素分析

FET周期中，3组患者的着床率(54.9%、52.1%、47.4%)和临床妊娠率(69.1%、66.8%、61.4%)随着Gn用量的增加，均有逐渐下降的趋势，且3组之间两两比较，差异均具有统计学意义(P<0.05)；3组间流产率、异位妊娠率及持续妊娠率比较均无统计学差异(P>0.05)(表4)。

表3 FET周期中基础临床数据的比较[(-±s)，n(%)]

注：与A组比较，*P<0.05

表4 FET周期中Gn用量与妊娠结局的单因素分析[(-±s)，%]

注：与A组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05。着床率数据分布为非正态分布，采用Kruskal Wallis秩和检验方法分析

五、FET周期中Gn用量与妊娠结局的多因素logistic分析

因患者基线不齐，组间比较存在混杂因素，故进一步采用多因素logistic分析，调整表1、表2和表3中具有统计学差异的混杂因素[10，12-18]，结果显示，着床率、临床妊娠率、流产率、异位妊娠率及持续妊娠率在不同的Gn使用量组别之间的统计学差异消失(P>0.05)(表5)。

六、极高Gn使用剂量组与常规Gn使用剂量组临床结局分析

表5结果提示，3组间妊娠结局未见统计学差异，但是在单因素分析中，C组的着床率和临床妊娠率下降，那么，更高Gn累积用量是否对FET的妊娠结局产生影响呢，故本研究进一步利用平滑曲线拟合[19]对Gn用量和妊娠结局进行多因素分析，结果显示各项指标均随Gn用量变化而变化，而当Gn用量极高时(≥60支)，妊娠结局发生显著改变，故以Gn用量60支为截点，把临床资料分为两组，常规组(n=1 828)：Gn使用量<60支；极高组(n=95)：Gn使用量≥60支。结果显示，极高组着床率和临床妊娠率(39%、50.5%)均低于常规组(52%、66.3%)，采用单因素和多因素logistic分析，均具有统计学差异(P<0.05)(表6、7)。

表5 FET周期中Gn用量与妊娠结局的多因素logistic分析

表6 Gn累积使用量常规组和极高组着床率比较(-±s)

注：与常规组比较，*P<0.05

表7 Gn累积使用量常规组和极高组临床妊娠率比较[n(%)]

注：与常规组比较，*P<0.05

讨 论

本研究中，共纳入1 923个FET周期，既往促排卵过程中，在不同剂量Gn使用组之间，高剂量组患者具有较高的年龄、BMI、基础FSH，较长的不孕年限，且促排卵天数增加，获卵数减少(表1、2)。主要原因可能与年龄、基础FSH和卵泡数与患者的卵巢储备功能相关[22]，进一步影响了促排卵方案的选择以及Gn使用量[23]。因此，单因素分析结果显示，高剂量组的着床率和临床妊娠率降低(P<0.05)，调整混杂因素后，Gn累积使用量的高低与FET周期的临床结局无相关性(P>0.05)。本研究结果与Munch 等[2]研究结果相同。另外，本研究排除了差等质量胚胎，避免胚胎冻融过程产生的冰晶损伤(胚胎质量越差，冰晶损伤越大[24])，减少了胚胎质量对结局的干扰因素，提高了数据分析的可靠性。

在临床工作中Gn累积用量可以无限放大吗，是否存在阈值效应，目前尚未见相关报道。本研究进一步采用平滑曲线拟合对Gn用量和妊娠结局进行分析，结果中发现，当Gn用量大于60支的时，曲线出现了拐点。根据平滑曲线的拐点将临床资料分为常规组和极高组，通过单因素和多因素logistic分析，结果提示极高组的着床率和临床妊娠率(39%，50.5%)与常规组相比(52%，66.3%)下降，且具有统计学差异(P<0.05)。同时，考虑到年龄，基础卵巢功能等混杂因素，进行多因素logistic回归分析，发现着床率[β=-0.12，95%CI(-0.24，-0.01)]和临床妊娠[OR=0.52，95%CI(0.30，0.91)]发生率随Gn用量的增加而下降，提示临床工作中要对这部分患者人群高度重视。其原因可能是：(1)在常规组(卵巢功能正常)，Gn累积使用量不影响胚胎的染色体非整倍性率[25]，但在极高组，高剂量外源Gn的使用，可能增加染色体非整倍性率风险(Gn累计用量每增加1 000 U，染色体非整倍性率风险增加16.4%[25])；(2)高剂量外源性促性腺激素的使用可能影响卵母细胞成熟和减数分裂过程[26]，干扰卵泡的自然生长发育，从而介导染色体非整倍体和嵌合体的发生；(3)在促排卵过程中，多个卵泡同时发育，体内雌激素逐渐上升，与卵裂球的多核现象相关[27]。因此，极高剂量的Gn使用量，可能通过上述机制影响卵母细胞质量以及胚胎非整倍性率，进一步降低FET周期的临床结局。然而，本研究为回顾性研究，具有一定的局限性并且结局指标只关注了着床率和临床妊娠率，我们需要进一步的随访，对后期的活产率及妊娠并发症发生率方面做进一步研究。

综上所述，促排卵过程中极高剂量Gn(≥4 500 U)的使用，可能导致卵母细胞或胚胎的染色体异常，降低后期FET周期的胚胎着床率和临床妊娠率，因此，在新鲜周期促排过程中应控制Gn用量在60支之内(<4 500 U)，以改善后续FET周期的妊娠结局。