不同发酵时长郫县豆瓣酱品质对比研究

邓维琴，陈功,2，张其圣,2，张帅，杨国华，李峰，李恒,2*

(1.四川省食品发酵工业研究设计院，成都 611130；2.四川东坡中国泡菜产业技术研究院，四川 眉山 620030；3.四川省丹丹郫县豆瓣集团股份有限公司，成都 611732)

郫县豆瓣酱是以红辣椒、蚕豆为主要原料，食用盐、小麦粉等为辅料酿制而成的，具有色红褐、油润、酱酯香、瓣粒香脆、味鲜辣等特点[1]。其生产工艺主要包括制曲、甜瓣子发酵、辣椒坯发酵及混合后发酵生香等阶段[2,3]。豆瓣酱的发酵过程中会分解原料中的蛋白质、淀粉等大分子物质，产生醇、酸、酯等呈味物质，赋予豆瓣酱独特的色泽、香气、滋味、形态，使豆瓣酱营养丰富，风味独特[4]。在豆瓣酱的发酵过程中，原料中的成分在微生物代谢产生的各种酶的作用下分解和重组，生成了各种活性物质、纤溶酶、呋喃酮类化合物和类黑精素等。发酵豆瓣酱具有促进机体代谢；调节肠道菌群，促进消化；抗氧化；预防肝癌等保健作用[5-8]。目前豆瓣酱主要分为红油豆瓣和特级豆瓣，有的特级豆瓣发酵时间较长，有的甚至达到5年的时间，这些长时间发酵的豆瓣风味较好，受到消费者的喜爱。

评价郫县豆瓣品质等级的依据包括色泽、香气、滋味等感官指标以及水分、氨基酸态氮、总酸等理化指标。由于发酵过程中各种微生物代谢、蛋白酶的分解作用、理化反应等，郫县豆瓣的水分、总酸、氨基酸态氮、氨基酸等理化指标会随之发生变化[9-11]；亦有报道指出，随着发酵时间的延长，郫县豆瓣中的风味物质呈现出差异[12]。

对“川菜之魂”——郫县豆瓣酱的品质分析是极为重要的工作。目前关于不同发酵时长郫县豆瓣酱(尤其是长时间发酵的豆瓣酱)的理化指标及风味物质等的研究报道较少，亦缺乏各指标与发酵时间的关系分析。

本文旨在通过对不同发酵时间(长时间发酵，长达96个月)的郫县豆瓣酱的理化指标、风味物质等因素的测定，揭示随发酵时间的变化郫县豆瓣酱的品质差异，为不同发酵时间豆瓣酱的品质分析提供了数据参考，对长时间发酵豆瓣酱独特品质的认可和推广起着促进作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

发酵10个月的豆瓣酱、发酵24个月的豆瓣酱、发酵36个月的豆瓣酱、发酵54个月的豆瓣酱、发酵96个月的豆瓣酱：均取自四川省郫县鹃城豆瓣有限公司。

NaOH、盐酸、苯酚、甲醛：均为分析纯。

1.2 仪器设备

6890N-5973i气质联用仪 美国Agilent公司；30/50 μm DVB/Carboxen/PDMS固相微萃取头及手柄 北京八方世纪科技有限公司；雷磁pH SJ-4F计 上海仪电科学仪器股份有限公司；L-8900型全自动氨基酸分析仪 HATACHI(日本日立)公司。

1.3 方法

1.3.1 理化指标的测定

水分含量的测定：参照国标GB 5009.3-2010[13]的方法；

总酸的测定：参照国标GB/T 5009.39-2003的方法[14]。

氨基酸态氮的测定：参照国标GB/T 5009.40-2003的方法[15]。

氨基酸总量的测定：参照国标GB 5009.124-2016的方法[16]。

1.3.2 挥发性风味物质的测定

采用2010 Utra GC-MS(SHIMADIU 公司)对不同发酵时期豆瓣酱的风味物质进行测定，分析不同发酵时期豆瓣酱风味物质的动态变化。

准确称取2 g粉碎的样品，放入15 mL 的样品瓶中，将样品瓶放入60 ℃水浴中预热2 min，然后将萃取针头插入样品瓶中，60 ℃恒温顶空萃取40 min 后，插入GC-MS 进样口解吸5 min，然后检测分析。

检测条件：DB-WAX 毛细管柱(60 m×0.25 mm，0.25 μm)；载气为氦气，流速1 mL/min；进样口温度250 ℃；不分流进样；升温程序：起始温度50 ℃，以6 ℃/min升至85 ℃(保留1.5 min)，再以2.5 ℃/min升至148 ℃(保留1 min)，以5 ℃/min 升至220 ℃(保持2 min)，最后以10 ℃/min升至250 ℃。质谱条件：EI 电离源，电子轰击能量70 eV；离子源温度230 ℃；接口温度250 ℃；质量扫描范围35～350 amu；检测器电压0.1 kV；调谐文件stuneu；扫描模式scan。

挥发性成分的鉴定结果由NIST05谱库检索与人工图谱解析共同确定，保留指数的计算方法参考文献进行，化合物相对含量的确定采用面积归一化法进行定量分析。

2 结果与分析

2.1 水分

郫县豆瓣酱的晾晒时间与水分含量的关系见图1。

图1 不同发酵时长豆瓣酱中水分含量Fig.1 Water content of broad bean sauce in different fermentation time

由图1可知，随着发酵时间的增加，豆瓣酱中水分含量呈逐渐减少趋势，由10个月时的58%降至96个月时的45%。即发酵时间越长，郫县豆瓣酱中的水分含量越低。国标规定，特级豆瓣酱、一级豆瓣酱、二级豆瓣酱的水分含量应当分别小于53%，57%和60%。结果显示：本试验所取5份样品均满足二级豆瓣酱对水分的要求，但仅发酵时长达到36个月后的样品(水分含量为52.44%)满足特级豆瓣酱的要求。

2.2 总酸

豆瓣酱的晾晒时间与总酸含量的关系见图2。

图2 不同发酵时长豆瓣酱中总酸含量Fig.2 Total acid content of broad bean sauce in different fermentation time

由图2可知，豆瓣酱中总酸含量随着发酵时间的延长呈总体增加趋势。其中，10～24个月期间总酸含量略有降低；发酵24个月以后豆瓣酱中的总酸含量逐渐增加，发酵96个月后达2.25 g/kg。总酸含量的增加可能是乳酸菌等微生物代谢产生乳酸、乙酸等有机酸，导致有机酸逐渐积累，酸度逐渐增加。

2.3 氨基酸态氮

豆瓣酱中氨基酸态氮含量与发酵时长的关系见图3。

图3 不同发酵时长豆瓣酱中氨基酸态氮含量Fig.3 Amino acid nitrogen of broad bean sauce in different fermentation time

由图3可知，郫县豆瓣酱中氨基酸态氮含量随其发酵时间延长逐渐增加，其含量由10个月时的0.27 g/100 g增加至96个月时的0.49 g/100 g。本试验的各样品中氨基酸态氮含量均高于国标规定特级豆瓣酱的氨基酸态氮含量(≥0.25 g/100 g)。氨基酸态氨是蛋白质的分解产物，它能使郫县豆瓣酱鲜味柔和，改善色泽，调和香气，氨基酸态氮是评价郫县豆瓣酱质量的重要因素之一。原料中的蛋白质含量及蛋白酶含量对豆瓣酱产品中氨基酸态氮含量有极大的影响。由本试验结果可知各试验样品的氨基酸态氮含量均达到较高水平，且随发酵时间的增加，由于蛋白酶的持续分解作用使豆瓣酱中氨基酸态氮含量逐渐增加，豆瓣酱品质也因氨基酸态氮含量增加而提升。

2.4 氨基酸

豆瓣酱中氨基酸含量与发酵时长的关系见图4。

图4 不同发酵时长豆瓣酱氨基酸总量Fig.4 Total content of amino acid of broad bean sauce in different fermentation time

由图4可知，郫县豆瓣酱中氨基酸总量随其发酵时间的延长而逐渐增加，经过96个月的发酵，其中氨基酸总量达到7.63 g/100 g。

图5 不同发酵时长豆瓣酱中氨基酸组分分析Fig.5 Analysis of amino acid components of broad bean sauce in different fermentation time

由图5可知，各发酵时长的豆瓣酱中均检出谷氨酸、天门冬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸等18种氨基酸，且均以谷氨酸和天门冬氨酸含量最高，且含量均随着发酵时间的延长而逐渐增加，对豆瓣酱的鲜味贡献很大。天门冬氨酸由10个月时的0.65 g/100 g增加到8年的0.94 g/100 g；谷氨酸10个月的含量是1.14 g/100 g，发酵8年的豆瓣酱中其含量增加到1.4 g/100 g。各试样中的氨基酸是在发酵体系中蛋白酶系分解蛋白质产生的，逐渐积累，因此也使得其中氨基酸态氮含量逐渐上升。但由于美拉德反应会消耗氨基酸，因此长时间发酵的豆瓣酱中氨基酸含量增加的趋势较为缓慢。

2.5 挥发性风味物质

不同发酵时间豆瓣酱中风味物质的种类见图6。

图6 不同发酵时长豆瓣酱中挥发性风味物质种类Fig.6 Analysis of the species of volatile flavor substances of broad bean sauce in different fermentation time

由图6可知，发酵10个月的豆瓣酱中挥发性风味物质共143种，其中醇类物质32种，酯类物质36种；2年豆瓣酱中挥发性风味物质共158种，其中醇类物质35种，醛类物质36种；3年豆瓣酱中挥发性风味物质共170种，其中醇类物质36种，酯类物质26种，酮类物质共24种；4.5年豆瓣酱中挥发性风味物质共137种，其中醇类物质28种，烷类物质21种；8年豆瓣酱中挥发性风味物质共120种，其中醇类物质21种，酮类物质18种。本试验鉴定出的挥发性风味物质种类远多于同类研究报道的郫县豆瓣酱中的53种和66种。

图7 豆瓣酱中挥发性风味物质GC-MS总离子流图Fig.7 GC-MS total ion flow graphs of volatile flavor substances of broad bean sauce in different fermentation time

注：a为10个月；b为24个月；c为36个月；d为54个月；e为96个月。

本试验优化了萃取方法和检测条件，采用的萃取温度较高(60 ℃)，且检测升温程序较慢，最终温度达到250 ℃，由总离子色谱图(见图7)可知，本试验采用的方法分离度好，高温条件下分离检测出的挥发性风味物质种类多，检测效果好。

豆瓣酱样品中相对含量较高的挥发性风味物质的含量见表1。其中，4-乙基愈创木酚、4-乙基-苯酚、2-乙基-1-己醇、芳樟醇、3-呋喃甲醇、苯乙醇、苯乙醛、5-甲基-2-苯基-2-己烯醛、3-甲基-丁酸、壬酸、(R)-(+)-香茅酸、辛酸、正葵酸、1-(1H-吡咯-2-基)-乙酮、二十一烷、十八烷、3-甲基-十四烷、十六烷等物质为各豆瓣酱样品共有的风味物质；其中，苯甲醛、4-乙基-苯酚、4-乙基愈创木酚、芳樟醇、苯乙醇、苯乙醛、5-甲基-2-苯基-2-己烯醛相对含量较高，表明这些物质可能是郫县豆瓣酱的主要风味来源，这与Li 等[17]的研究结果一致。李治华等测定的以成熟1年为代表的传统豆瓣酱和商业豆瓣酱中共有的主要挥发性风味物质是4-乙基-2-甲氧基苯酚、苯乙醇、苯甲醛、苯乙醛、水杨酸甲酯，在本试验不同年限豆瓣酱中均有检出[18]。张玉玉等分析不同年份豆瓣酱得出3个月、1年、3年的豆瓣酱中共有的主要挥发性成分为苯甲醛、苯乙醛、3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇、2,6,6-三甲基-2-环己烯-1,4-二酮、4-乙基愈创木酚、十七烷、十六酸乙酯，这与本试验研究结果一致。

表1 不同发酵时间豆瓣酱中挥发性成分表Table 1 Volatile components of broad bean paste in different fermentation time

续 表

续 表

续 表

注：“-”表示未检出。

另外一部分风味物质如乙基苯乙醇、1-庚基-环戊烯、水杨酸甲酯、异佛尔酮、苯乙酮、2,6,6-三甲基-2-环己烯-1,4-二酮、2-戊基-呋喃等则仅出现在2年和3年的豆瓣酱中，其他发酵时长的豆瓣酱中均未检出。可以认为，这些物质是豆瓣发酵过程中产生的非特征性成分，对豆瓣酱的风味影响不大；而丁酸，2-甲基-戊酯、2-乙基-1,3-二氧戊环-4-甲醇、1-((1-丁氧基-丙-2-基)氧基)丙-2-基异丁基碳酸酯、2-哌啶酮等物质在长时间(36～96个月)发酵豆瓣酱中才检出，1-(1H-吡咯-2-基)-乙酮、苯乙醛、丁酸，2-甲基-戊酯等风味物质随着发酵时间的延长含量逐渐增加，广受消费者青睐的陈年豆瓣酱特有风味可能正是来源于此类物质。

3 结论与讨论

本研究首次对不同年份尤其是长时间发酵(54，96个月)的豆瓣酱的理化指标和风味物质进行测定以分析发酵时长对郫县豆瓣酱品质的影响。理化指标测定结果表明，随着发酵时间的延长，郫县豆瓣酱的水分含量逐渐降低，而氨基酸态氮和氨基酸含量则逐渐积累增加。另外，豆瓣酱中挥发性风味物质种类随发酵时间延长呈现先增加后减少的趋势，发酵36个月的豆瓣酱风味物质种类最多(170种)。其中，醇类、酸类、酯类、酮类、醛类和烷烃类物质较多，与已有的研究结果较一致。其中4-乙基-2-甲氧基-苯酚和4-乙基-苯酚、苯乙醛、5-甲基-2-苯基-2-己烯醛、1-(1H-吡咯-2-基)-乙酮在不同年份样品中均有检出，为主要挥发性风味物质。丁酸，2-甲基-戊酯、2-乙基-1,3-二氧戊环-4-甲醇、1-((1-丁氧基-丙-2-基)氧基)丙-2-基异丁基碳酸酯、2-哌啶酮等是长时间发酵豆瓣酱(54，96个月)所独有的挥发性风味物质，赋予长时间发酵豆瓣酱不同的风味。综合试验分析，长时间发酵的豆瓣酱营养价值和风味更佳，值得进一步对其安全性进行分析并推广。

此外，长时间发酵豆瓣酱风味的形成是各种微生物、酶综合作用的结果，同时伴随着美拉德反应的进行，会消耗体系中的还原糖、氨基酸、蛋白质、呋喃酮类化合物和类黑精素等，影响豆瓣酱的风味和色泽。随着豆瓣酱发酵时间延长，各种反应产物的含量及种类都有变化，本研究仅对氨基酸态氮、氨基酸、挥发性风味物质等进行分析，对美拉德反应条件及反应产物没有进行研究。此外，挥发性风味物质的形成与假单胞菌、醋酸菌、乳酸菌等微生物的作用息息相关[19,20]，但这些微生物在长时间发酵豆瓣酱中的存活情况及代谢情况有待进一步研究。