超声波辅助提取花生壳总黄酮的工艺研究

萨如拉，彭晓亮，饶德英

（赤峰学院 生命科学学院，内蒙古 赤峰 024000）

花生（拉丁名：Arachis hypogaea Linn），因为地上开花地下结果，因而得名落花生,蔷薇科草本植物.原产地为南美洲大陆，因其产油量高，营养丰富，而被广泛种植.目前全球种植花生的国家已经达到100余个，其中亚洲花生产量最高，非洲次之[1].

花生在我国的种植历史悠久，文献显示[1]，花生在中国的种植始于清朝.新中国成立以后，花生作为重要的油料作物，国家将重点扶持种植，目前我国的花生年产量高达1500万吨.中国花生的种植主要在亚热带地区，主要集中在河北、山东、河南和安徽等地.花生具有重要的经济价值，主要体现在两方面:一方面它是重要的油料作物，产油量远高于同类作物，高达50%[2].另一方面，它具有重要的药用价值.《本草求真》中记载服用花生可以治疗乳汁缺少的症状[2].

花生在其进一步加工生产的过程中，将产生约其重量1/3的花生壳，通常这些花生壳被焚烧或作为废物掩埋，只有少数用于饲料加工和工业用途，这不仅污染环境，而且也无法充分利用资源，无法最大限度地提高经济效益.花生壳中除了含有大量的碳水化合物外，还含有丰富的甾族化合物[2].其中的甾醇类物质经人工提纯后可以作为抗氧化的保健品，在人体抗衰老和免疫过程中发挥着重要的作用.花生壳中还富含黄酮类物质，这是一种多酚类物质，具有潜在的药用价值，在已有的文献[2]中表明，黄酮类物质有显著降低胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白（LDL）的功效，在治疗高血脂及其心血管疾病方面也有较好的疗效[3].目前，从花生壳中提取黄酮类物质的方法较多，如采用乙醇萃取法、超声破碎提取法、蛋白酶水解法等.本文使用萃取法为主体，使用乙醇作为萃取试剂，采用超声波辅助的方法，对单一的萃取工艺进行改进，目的是提高花生壳中黄酮类物质的提取率，并探索由工业大规模提取花生壳中的黄酮类物质的途径.

1 材料与试剂设备

1.1 材料与试剂

花生壳：花生购于赤峰市，去豆处理后，对花生壳机械粉碎，经60目筛选后，备用.

试剂：无水乙醇（Ethanol absolute）、亚硝酸钠（NaNO2）、硝酸铝（Al(NO3)3）、氢氧化钠(NaOH)、芦丁标准品（20mg装）.

1.2 仪器与设备

微波光波超声波萃取仪、旋转蒸发器、外可见分光光度计、低速离心机、粉碎搅拌机.

2 实验方法

2.1 花生壳总黄酮超声波辅助提取工艺流程

流程：去豆→粉碎→过筛→加提取剂→超声波辅助提取→离心→定容→测定

2.2 芦丁标准曲线的制作

芦丁属于常见黄酮物质的一种，花生壳中的黄酮类物质中芦丁含量居首，且所有的黄酮类物质都具有相似的结构，因此可以用芦丁代替总黄酮类物质的含量[4].将20mg芦丁标准品溶于70%乙醇中并使其达到体积的200mL,配置成浓度为100μg/mL的标准液（以下简称芦丁标准液）.

用移液器依次准确吸取 0mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL 芦丁标准液置于 10mL带有编号为1-7的具塞试管中，随后，加入0.5mL质量分数为5%的亚硝酸钠并放置5min.然后加10%硝酸铝溶液0.5mL，涡旋振荡5min；最后，加入4mL 4%氢氧化钠溶液，涡旋，用70%乙醇定容到10mL，涡旋.静置15min后，吸取1号管中的溶液于玻璃比色皿中做空白调零，随后，依次吸取2-7号管中溶液，用分光光度计测定510nm波长下溶液的吸光度.以溶液的吸光度为纵坐标，以芦丁的浓度作为横坐标绘制标准曲线[4].

2.3 单因素实验

测定不同超声时间，不同超声功率，不同乙醇体积分数和不同料液比下花生壳中总黄酮的提取率.每种因素进行3次重复试验并且取其平均值.

2.3.1 提取时间对花生壳中总黄酮提取率的影响

乙醇浓度70%、料液比1：50，提取温度30℃，提取超声功率300W，在此条件下研究不同的提取时 间 20min，30min，40min、50min、60min 和 70min对花生壳中总黄酮提取率的影响.

2.3.2 超声功率对花生壳总黄酮提取率的影响

乙醇浓度70%、料液比1：50，提取温度30℃，提取时间60min条件下研究不同的功率300W、350W、400W、450W、500W和550W对花生壳中总黄酮提取率的影响.

2.3.3 乙醇浓度（体积分数）对花生壳中总黄酮提取率的影响

料液比1:50，提取温度30℃，超声功率500W，提取时间60min条件下研究不同的乙醇体积分数50%、60%，70%，80%和90%对花生壳中总黄酮提取率的影响.

2.3.4 料液比对花生壳中总黄酮提取率的影响

乙醇浓度70%，超声功率500W，提取温度30℃，提取时间60min条件下研究不同料液比1：30、1：40、1：50、1：60、1：70 和 1：80 条件下对花生壳中总黄酮提取率的影响.

2.3.5 提取花生壳中总黄酮的正交试验设计

在单因素试验的基础上，在每个单因素中，选取三个具有最高提取率的梯度进行正交试验，并使用 L9（43）正交设计（见表 1）.

表1 正交试验因素水平表

2.3.6 验证试验

单因素试验的最佳组合与正交试验最优组合进行比较选取提取率高的一组作为最终的提取条件.

3 试验结果与分析

3.1 芦丁标准曲线

表2 不同质量浓度芦丁的吸光值

图1 芦丁标准曲线

根据标准曲线得到的回归方程为y=0.009x-0.0054，R2=0.9988

3.2 花生壳提取物中总黄酮含量的计算

吸取1.0mL花生壳提取液置于10mL试管中，按照芦丁标准溶液测定法测定黄酮浓度.

花生壳总黄酮提取率（%）

其中C—提取液黄酮浓度（μg/mL）

V—提取液体积(mL)

n—提取液稀释倍数

m—花生壳质量（g）

3.3 单因素试验

3.3.1 不同提取时间下对花生壳中总黄酮提取率的影响

表3 不同提取时间下花生壳中总黄酮的提取率

图2 不同提取时间对花生壳中总黄酮提取率的影响

如图2，在60min之前，黄酮的提取率随着时间的延增加而增加，60min后，随着提取时间的增加提取率基本保持不变，这是由于花生壳中的黄酮类物质在60min左右基本完全提取，随着时间增加提取率将基本保持平稳[5].在60min左右黄酮提取率最高.所以选择提取时间为60min作为花生壳中总黄酮适宜的提取时间.

3.3.2 不同超声功率下对花生壳中总黄酮提取率的影响

表4 不同超声功率下花生壳中总黄酮的提取率

图3 超声功率对花生壳中总黄酮提取率的影响

如图3所示，在功率为400W之前，由于功率较低，花生壳细胞壁被破坏不完全，总黄酮提取率较低.随着超声功率的增加，黄酮类化合物的提取率逐渐增加.在超声功率为400-450W之间变化不明显，450-500W之间又呈现上升的趋势，500W后，由于超声功率过大引起黄酮类降解，再次开始下降[7].考虑到资源的节约以及超声噪音的污染[8]，选择提取花生壳中总黄酮超声功率为500W为宜.

3.3.3 不同乙醇浓度（体积分数）对花生壳中总黄酮提取率的影响

表5 不同乙醇浓度下花生壳中总黄酮的提取率

图4 乙醇浓度（体积分数）对花生壳中总黄酮提取率的影响

如图4所示，在乙醇浓度超过70%、80%前，花生壳中总黄酮的提取率随乙醇浓度的增加而增加，但由于花生壳内黄酮类物质有限，在提取率上升到一定程度时便保持平稳，当乙醇浓度超过70%、80%后，由于除黄酮物质外的其他成分溶出增多，影响后续的黄酮含量测定[9].因此，选取乙醇体积分数为70%作为花生壳中总黄酮的适宜提取浓度.

3.3.4 不同料液比对花生壳中总黄酮提取率的影响

表6 不同料液比对花生壳总黄酮的提取率

图5 料液比对花生壳总黄酮提取率的影响

由图5所示，在乙醇的料液比增加到（1：70）之前，总黄酮的提取率随乙醇体积的增加而逐渐上升，这是由于提取剂越多总黄酮的溶出量越多，但是由于总黄酮的含量有限，在料液比为1:70之后，提取率呈现出缓慢下降的趋势，考虑到节约提取剂以及能源的消耗[10]，提取花生壳中总黄酮选用料液比为1:70较为恰当.

3.4 提取花生壳中总黄酮正交试验结果

在黄酮类化合物提取单因素的试验基础上，对提取时间、超声功率、乙醇浓度、料液比四个因素进行正交试验.以期待进一步获得超声波萃取花生壳中黄酮类化合物的工艺条件，结果见表2.从表2中的极差R可知，影响总黄酮提取率的因素的主次顺序是：乙醇浓度＞超声功率＞时间＞料液比，优化后的提取工艺条件为A2B2C2D2，即提取时间为60min，料液比为1:70，提取功率为500W，乙醇浓度为80%，提取率为3.25%

表7 正交试验结果与分析

3.5 验证试验结果

从花生壳中提取总黄酮的单因素试验确定的最佳条件下进行花生壳中总黄酮的提取，即提取时间60min，料液比1:70，提取功率500W，乙醇浓度80%，提取率为3.25%.与花生壳中总黄酮提取正交试验表中所有组合相比得到提取率最高的组合为A2B1C3D3，即提取时间为 60min，料液比为 1：60，提取功率为550W，乙醇浓度为90%，在此条件下黄酮的提取率能达到3.39%.高于其他任意一组优化条件的提取率.因此通过该提取试验获得的最佳的提取优化条件为提取时间60min，料液比1:60，提取功率550W，乙醇浓度90%.

4 结论

本研究中使用超声波辅助方法，通过单因素试验和正交试验来确定在从花生壳中提取总黄酮的最佳条件.即提取时间为60min，料液比为1：60，提取功率550W，乙醇浓度90%.本研究的工艺得到了对单一萃取法的改进，例如，在李杰、肖连东等人的所著的《花生壳中总黄酮提取工艺条件的优化》中总黄酮的最终提取率仅为1.74%，本研究的超声波辅助提取后的最终提取率达到了3.39%，得到了大概2倍的提取率.超声波辅助法大大缩短了单一萃取法的提取时间，达到了高效节能的目的，并且乙醇可以回收，利用成本较低，没有污染和浪费.在黄酮类化合物的大规模工业生产中具有广阔的应用前景.