河南省烟粉虱传播的番茄病毒病分子鉴定

万秀娟　胡京昂　李自娟　应芳卿　黄文

摘 要： 为了探究河南省番茄主产区是否受到烟粉虱传播的番茄黄化曲叶病毒、番茄褪绿病毒和番茄侵染型褪绿病毒的复合侵染，采集叶片边缘卷曲、叶片皱缩、叶脉间黄化褪绿、植株矮化的疑似烟粉虱传播的3种病毒病的番茄植株样品，分别用TYLCV、ToCV和TICV特异性引物对样品进行PCR和RT-PCR检测。结果表明，TYLCV和ToCV的特异性引物分别扩增得到约780 bp和 460 bp左右的特异性条带，该条带与TYLCV和ToCV阳性对照大小一致，且与这2种病毒郑州分离物核苷酸序列同源性均在99%以上；TICV特异性引物未扩增出目的条带。说明河南主栽区番茄受到烟粉虱传播的番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒的复合侵染。

关键词： 番茄；烟粉虱；病毒病；分子鉴定

Molecular identification of whitefly transmitted tomato viruses in Henan

WAN Xiujuan， HU Jingang， LI Zijuan， YING Fangqing， HUANG Wen

（Zhengzhou Vegetable Research Institute，Zhengzhou 450015， Henan， China）

Abstract： In order to explore the viruses which transmitted by whitefly， Tomato chlorosis virus （ToCV）， Tomato yellow leaf curl virus （TYLCV） and Tomato infectious chlorosis virus （TICV） were studied in this paper. The samples which showed symptoms of marginal curling， leaf shrinkage， interveinal chlorosis and dwarf plant were collected in the main tomato areas of Henan Province. Using specific primers of ToCV， TYLCV and TICV， ToCV， TYLCV and TICV were detected by RT-PCR and PCR. The result showed that， the specific primers of TYLCV and ToCV amplified a 780 bp specific band and a 460 bp specific band separately. The two specific bands were amplified with the same size as the positive control by the two sets of specific primers ， and the nucleotide sequence homology between these two viruses and Zhengzhou isolates was above 99%. But no bands of TICV were amplified by RT-PCR by the set of specific primers. Tomato plants were infected by both ToCV and TYLCV in the main planting areas of Henan.

Key words： Tomato； Whitefly； Virus disease； Molecular identification

番茄（Solanum lycopersicum L.）是我国重要的经济作物，在全国各地都有种植，随着种植结构的调整，种植面积逐渐增大。据报道，番茄每年春季因病毒病减产30%以上，夏、秋季损失更为严重，有的年份或地块几乎绝收[1-2]。近几年，由烟粉虱传播的番茄黄化曲叶病毒病（Tomato yellow leaf curl virus disease， TYLCVD）和番茄褪绿病毒病（Tomato chlorosis virus disease， ToCVD）严重危害番茄产业的发展[2-3]。

烟粉虱传播的病毒病主要有番茄黄化曲叶病毒病（Tomato yellow leaf curl virus， TYLCV）、番茄褪绿病毒病（Tomato chlorosis virus， ToCV）和番茄侵染性褪绿病毒病（Tomato infectious chlorosis virus， TICV）。TYLCV屬于双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）。该病毒最早于1939年在以色列约旦河一带被发现，1964年被正式命名，主要通过烟粉虱（Bemisia tabaci）传播，也可通过嫁接传播，但不经机械摩擦和种子传毒，寄主主要有番茄、曼陀罗、辣椒、菜豆和烟草等[4]。番茄被TYLCV侵染后，植株生长缓慢甚至停滞，顶部叶片皱缩发黄，叶边缘上卷。番茄植株早期感染该病毒会影响正常开花结果；后期感染则导致结果少且果实小，严重影响番茄的产量和品质，番茄黄化曲叶病毒病给世界许多地区的番茄生产带来毁灭性灾害[5-9]。ToCV和TICV属于长线形病毒科（Closteroviridae）毛形病毒属（Crinivirus）。1998年在美国佛罗里达州首次发现了番茄褪绿病毒，随后意大利、巴西、以色列、中国等地也有相继报道[10-14]。番茄被ToCV侵染后，叶片褪绿、黄化，尤以植株下部叶片叶脉浓绿，脉间褪绿、黄化最为明显，貌似缺素症。在自然条件下，ToCV主要通过烟粉虱传播，侵染茄科、番杏科、苋科、夹竹桃科、藜科、菊科和蓝雪科等植物，不能通过摩擦接种的方式侵染植物[15]。近年来，由于全球气候变暖及保护地蔬菜面积增加，烟粉虱在全世界扩散与爆发，由烟粉虱传播的番茄病毒病给番茄生产造成了巨大损失。目前，防治由烟粉虱传播的番茄病毒病最有效的方法是种植抗病品种。

笔者主要通过分子生物学技术，利用TYLCV、ToCV和TICV的特异性引物，对河南省番茄主栽区的疑似样品进行检测，并建立一套快速的烟粉虱传播的番茄病毒病检测体系，为番茄病毒病的综合防治提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 待测番茄样品 2016年9月在郑州、中牟、新郑和济源的番茄大棚中采集叶脉褪绿，叶片边缘卷曲、皱缩、褪绿黄化的番茄叶片，-80 ℃低温保存备用。

1.1.2 生化试剂 RNA提取试剂TRIzol购自Invitrogen公司；RTase M-MLV（RNase H-）和RNase Inhibitor购自Promega公司；Taq DNA聚合酶、凝胶回收纯化试剂盒和DL2000 DNA Marker均购自杭州博日科技有限公司；dNTPs和T4 DNA Ligase 购自TaKaRa公司；其他生化试剂和化学试剂均为分析纯。

1.1.3 菌株、阳性对照和克隆载体 大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α菌株与TYLCV、ToCV阳性对照由郑州市蔬菜生物技术重点实验室保存，克隆载体pMD18-T 购自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 样品总RNA提取及RT-PCR 称取番茄叶片约0.1 g加入液氮研磨成粉末，按照TRIzol法提取植物总RNA，用于cDNA的合成。反转录体系（10 μL）：总RNA 5.0 μL，dNTP Mix 1 μL（10 mmol·L-1），ToCV和TICV下游引物ToC-6、TICVR 1.0 μL（10 μmol·L-1），RNase-Free H2O 3 μL，70 ℃变性10 min，立即冰上放置2 min，再加入5×M-MLV Buffer 5 μL，200 U·μL-1 RTase M-MLV（RNase H-）1.0 μL，40 U·μL-1 RNase Inhibitor 0.5 μL，RNase-Free H2O 8.5 μL，37 ℃水浴60 min。

PCR反应体系（25 μL）如下：cDNA 5.0 μL，Taq酶 1 μL（5 U·μL-1），ToC-5/ToC-6引物各1 μL（10 μmol·L-1），10×buffer 2.5 μL，dNTP Mix 1 μL（10 mmol·L-1），ddH2O 13.5 μL。扩增条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min[16]。根据Panno S等[17]报道，番茄侵染性褪绿病毒的检测应用TICVF/TICVR特异性引物，PCR反应体系同ToCV，扩增条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环；72 ℃ 10 min[2，17]。PCR产物用1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测拍照，并经胶回收试剂盒纯化后，将PCR产物克隆到pMD18-T载体，阳性克隆经验证后送北京三博远志生物技术有限公司测序。

1.2.2 植物总DNA提取及TYLCV检测 称取0.1 g番茄叶片样品，加入液氮充分研磨成粉末，参照 CTAB法[18]提取番茄叶片总DNA，用于后续试验。番茄黄化曲叶病毒检测采用TYLCV特异性引物TYLCV-CPF/TYLCV-CPR扩增，PCR反应体系（25 μL）如下：模板DNA 1.0 μL，Taq酶 0.5 μL（5 U·μL-1），TYLCV-CPF/TYLCV-CPR引物各1 μL（10 μmol·L-1），10×buffer 2.5 μL，dNTP Mix 1 μL（10 mmol·L-1），ddH2O 19 μL。扩增条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min[4]。PCR产物用1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测拍照，并经胶回收试剂盒纯化后，将PCR产物克隆到pMD18-T载体，阳性克隆经验证后送北京三博远志生物技术有限公司测序。各引物序列详见表1。

1.2.3 双重PCR检测ToCV和TYLCV 以ToC6反转录得到的cDNA和提取的叶片DNA为模板，ToC5/ToC6和TYLCV-CPF/TYLCV-CPR为引物，进行PCR扩增。PCR反应体系：10×PCR反应缓冲液5 μL，dNTPs 1.0 μL（2.5 mmol·L-1），ToC5/ToC6和TYLCV-CPF/TYLCV-CPR引物各1.0 μL（10 μmol·L-1），Taq酶1.0 μL（5 U·μL-1），cDNA模板1.0 μL DNA 5.0 μL，加ddH20至體积50 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性45 s，53 ℃复性45 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，72 ℃延伸10 min[19]。PCR产物用1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测拍照。

1.2.4 序列比对分析 利用NCBI序列比对工具BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）分析克隆获得4个样品的ToCV HSP70h部分序列和TYLCV CP的序列，根据相似性确定病毒种类，并与国际上报道的ToCV HSP70h与郑州分离物（KR 150985）和TYLCV郑州分离物（JQ 034622）进行序列相似性分析。

2 结果与分析

2.1 番茄疑似病株的田间表现

疑似复合感染ToCV和TYLCV的番茄植株，在抗TYLCV品种上表现为叶片沿叶脉褪绿变黄，叶片变脆，有坏死斑点等典型的ToCV症状；在感TYLCV品种上表现叶片边缘黄化、皱缩、叶片增厚和植株矮化等典型的TYLCV症状。

2.2 番茄疑似病株的分子检测

对在4个地区采集的疑似病株样品分别提取RNA和DNA，采用ToCV和TICV的特异性引物对样品进行RT-PCR扩增，所有样品中，ToCV特异性引物均扩增出460 bp左右的特异性条带，TICV特异性引物未扩增出目的条带；采用TYLCV的特异性引物TYLCV-CPF/TYLCV-CPR进行PCR扩增，4个地区样品中均扩增到约780 bp左右的条带（图1），序列比对分析表明，4个地区样品ToCV HSP70h和TYLCV外壳蛋白基因核苷酸序列与这2种病毒的郑州分离物同源性均在99 %以上。结果表明，4个地区的检测样品均被ToCV和TYLCV复合侵染。

2.3 双重PCR检测ToCV和TYLCV

以ToC6反轉录得到的cDNA和提取的叶片DNA为模板，ToC5/ToC6和TYLCV-CPF/TYLCV-CPR为引物，进行PCR扩增，每个样品中均扩增得到460 bp和780 bp左右的条带（图2），表明采用双重PCR可以通过1次PCR反应完成对2种烟粉虱传播的病毒病的分子检测。

3 讨论与结论

烟粉虱是番茄黄化曲叶病毒、番茄褪绿病毒和番茄侵染性褪绿病毒的共同传播媒介。近年来，番茄黄化曲叶病毒病已经成为河南地区番茄产区的普发病害。目前，种植番茄抗病品种是控制番茄黄化曲叶病毒病最安全、有效的途径。烟粉虱传播的番茄黄化曲叶病毒病、番茄褪绿病毒病以及番茄黄化曲叶病毒病和番茄褪绿病毒病复合侵染的分子鉴定已有报道[2-4，14]，笔者为了提高检测效率，通过对PCR反应体系和条件的优化，建立了一套检测TYLCV、ToCV和TICV 3种病毒复合侵染的方法。TICV侵染番茄后的症状与ToCV相似，笔者运用TICV的特异性引物对样品进行RT-RCR，所有样品均未扩增出目的条带，说明样品未受到TICV侵染，用TYLCV和ToCV特异性引物扩增，所有样品均扩增出目的条带，且与这2种病毒郑州分离物的核苷酸序列同源性均在99 %以上，说明样品均受到TYLCV和ToCV侵染。但是，在实际生产中种植的抗TYLCV番茄品种是否对ToCV表现抗病，或者是易被ToCV侵染，还需进一步研究。

TYLCV和ToCV在国内首次报道发生以来，已经成为国内各个地区危害番茄生产的主要病害。笔者利用分子生物学技术，对河南4个地区番茄疑似该2种病毒侵染的叶片样品进行检测，均检测到TYLCV和ToCV，属于复合侵染，这也是在河南首次明确番茄受到番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒的复合侵染。

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