星点设计-效应面法优化膏方煎煮工艺

朱 亮，王群星，王秀敏，颜 梅，徐菲拉#

(1.金华市中心医院中药房，浙江 金华 321000； 2.浙江中医药大学药学院，浙江 杭州 310053)

膏方具有滋补、预防及治疗疾病等作用，是针对人的体质、临床表现而拟定的复方汤剂经反复煎煮浓缩后加入特定的辅料制成的半流质剂型，为中医药八大剂型之一[1]。出膏率是指按照规定的煎煮工艺生产，100单位质量的中药材所产出的流浸膏或干浸膏的质量，与膏方的质量和成本关系密切，为中药生产过程中的重要参数[2]。膏方的煎煮工艺对出膏率具有极大影响，容易造成中药膏方质量的差异，直接影响其临床疗效[3]。优选中药煎煮工艺的方法主要包括正交设计法、均匀设计法和星点设计-效应面优化法(central composite design，CCD)。CCD法可通过模型拟合描绘三维效应面，从较优区域直接读取较优工艺条件，具有高精度、少试验等特点[4-6]。因此，本研究通过引入CCD法，选取金华市中心医院(以下简称“我院”)中药膏方处方中不同入药部位的常用药材作为考察对象，以出膏率为评价指标，考察膏方煎煮工艺，优选较优条件，以期为CCD法应用于膏方煎煮工艺提供依据。

1 材料

1.1 仪器

98-1-B型电子调温电热套(天津市泰斯特仪器有限公司)；旋转蒸发器RE-5203(上海亚荣生化仪器厂)；JZY-10型电动煎煮机、不锈钢煎煮锅(天津三延精密器械有限公司)；BT25S型电子天平(北京赛多利斯仪器有限公司)；DZF6050型真空干燥箱(上海顿克仪器科技有限公司)。

1.2 药品与试剂

制备膏方所需的药材购于浙江中医药大学中药饮片有限公司，均为《中华人民共和国药典》(2015年版)收载品种。

2 方法与结果

2.1 处方拟定

取我院膏方制备常用药材，按不同来源各称取5 g，其中根及根茎类：首乌、牛膝、炒白术、炒白芍、甘草、黄芪、熟地、麦冬及山药；皮类：瓜蒌皮、合欢皮、地骨皮、厚朴、杜仲、陈皮、黄柏及桑白皮；花类：玫瑰花、绿梅花、菊花、金银花及款冬花；种子果实类：女贞子、菟丝子、柏子仁、酸枣仁、五味子、山茱萸及车前子；全草类：寄生、淫羊藿、白花蛇舌草、益母草、蒲公英、石斛及仙鹤草，混合备用。

2.2 出膏率测定方法

将总煎煮液通过预先称定质量的微孔滤膜。过滤后，取出滤膜，并移置真空干燥箱中干燥至恒质量，滤膜所增加的质量即为不溶物质量(M4)。称定浓缩液总质量(M1)，称取浓缩液供试品(M2)约5 g，置于已称定质量的蒸发皿，在水浴上干燥至浸膏，并移置真空干燥箱中干燥至恒质量，得供试品干质量(M3)，按公式(1)[出膏率(%)=(M1/M2)×(M3-M4)/处方投料量×100%]计算即得[7]。

2.3 单因素分析

2.3.1 冷浸时间考察：称取膏方药材5份，用10倍量水分别浸泡0.5、2、4、6及12 h，滤出水分，并测定滤出水分体积，计算吸水率，按公式(2){药材吸水率(%)=[吸水后药材质量(g)-吸水前药材质量(g)]×100%/吸水前药材重量(g)}计算即得[8]，测定各个时间段的吸水率分别为40.82%、78.57%、92.86%、102.97%及104.00%。结果表明，随着冷浸时间的增加，吸水率随之增长，在6 h后吸水率基本不再增长，结合膏方制作周期，故冷浸时间以6 h为考察对象。

2.3.2 煎煮次数考察：称取膏方药材5份，称定，用10倍量水浸泡6 h，煎煮时间2 h，分别煎煮1、2、3、4及5次，测定出膏率分别为17.5%、32.1%、42.8%、43.8%及45.6%。结果表明，随着煎煮次数增加，出膏率也增长，煎煮2次后，出膏率增长已较为平缓，故煎煮次数以2次左右为考察对象。

2.3.3 煎煮时间考察：称取膏方药5份，称定，用10倍量水浸泡6 h，煎煮2次，煎煮时间分别为0.5、1、2、3及4 h，合并滤液，测定出膏率分别为19.0%、32.0%、44.3%、43.5%及43.4%。结果表明，煎煮2 h出膏率最高，且随着煎煮时间的增加，出膏率变化不显著，故选择煎煮时间为2 h。

2.3.4 料液比考察：称取膏方药5份，称定，分别加入水1 080、1 440、1 800、2 160及2 520 ml(即料液比为1∶6、1∶8、1∶10、1∶12及1∶14)，浸泡6 h后煎煮2 h，各煎煮2次，合并滤液，测定出膏率分别为19.0%、32.2%、45.1%、44.3%及44.1%。结果表明，料液比为1∶10时出膏率达到峰值后无显著性变化。

2.4 膏方药材煎煮工艺优化

2.4.1 星点设计-效应面试验设计与结果：以煎煮次数、煎煮时间和料液比为考察因素，但煎煮次数为非连续变量难于作回归处理，因此结合预试验结果和生产的实际，将煎煮次数固定为2次。选择煎煮时间(X1)和料液比(X2)为考察因素，以浸膏得率为评价指标做二因素五水平的星点设计。根据星点设计原理，各因素设5个水平，用代码-a、-1、0、+1、a来表示。对于二因素星点设计a=1.414[9]。设定X1范围： 0.5～3.5 h；X2范围：6～14倍。试验因素水平、安排及结果分别见表1—2。

表1 星点设计试验因素水平表Tab 1 Central composite design/response surface methodology level

表2 星点设计试验安排及结果Tab 2 Arrangements and results of central composite design/response surface methodology

试验模型通过最小二乘法拟合二次多项式方程可以表达为：Y=b0+b1Xl+b2X2+b3X1X2+b4X12+b5X22。其中Y为效应值(出膏率)，r为二项式模型方程拟合度系数，其显著性由F值检验。

2.4.2 煎煮工艺优化结果分析：由design-expert 8.0得到星点设计的实验结果，见表3；效应面法对浸膏得率分析结果见图1—2。由图1可知，取值较小时，效应面较陡，说明此时煎煮时间和料液比的改变对出膏率的影响较明显。随着因素取值增大，效应面趋向于平缓，提示此时煎煮时间和料液比的改变对出膏率的影响不显著。

图1 提取时间和料液比对出膏率影响等高线图Fig 1 Contour map of effects of extraction time and material liquid ratio on paste ratio

2.4.3 模型拟合：模型拟合的目的就是用数学模型来近似拟合函数，当其接近到一定可信程度，就可以用于分析和优化操作。模型拟合的结果优劣可以用方差分析来进行判断[10]。二项式拟合公式：Y=-63.84+26.51A+13.31B-5.41A2-0.56B2(r=0.917，P<0.01)。方差分析结果见表4。由表4可知，该模型拟合度较好，可用于预测试验结果。回归模型系数显著性结果表明：液料比、煎煮时间的平方对膏方得率的影响极显著；料液比的平方及煎煮时间对膏方得率的影响显著。结合较优模型结果，各因素对膏方得率影响的显著性由大到小为液料比>煎煮时间。

图2 提取时间和料液比对出膏率影响3D效应图Fig 2 3D diagram of effects of extraction time and material liquid ratio on paste ratio

表3 膏方药材煎煮工艺星点试验设计与结果Tab 3 Design and results of water extraction by central composite design/response surface methodology

表4 二次回归模型方差分析结果Tab 4 Quadratic regression model analysis of variance

注：**P<0.01，*P<0.05

2.4.4 效应面优化和验证：根据自变量较优预测范围，选取的工艺条件为11.8倍量水，煎煮2.4 h，根据所得的工艺条件进行3次验证试验，得到的出膏率平均为46.07%，RSD为1.43%。各考察指标与预测值相比较，偏差都较小，见表5；表明所建立的数学模型具有良好的预测性，本工艺为煎煮工艺条件所得的出膏率较稳定，验证该工艺可行。

3 讨论

膏方在中医药防治疾病中起着重要的作用[11]。随着中医“治未病”预防保健工作的开展和个体化膏方的兴起，膏方业务在各大医院和药店迅猛发展[12]。但中药膏方的煎煮工艺存在药材浪费严重、工艺复杂及制备耗时长等问题，其粗放的制作工艺可能会直接影响临床疗效。相关文献多采用正交试验优选膏方煎煮工艺[13]，但该法采用线性数学模型，精度不高且无法精确找到最佳点，条件优选仅凭经验，无法考察各因素间的相互作用等。星点设计则是采用非线性数学模型拟合，是集数学和统计学方法于一体的研究方法，通过模型拟合构建的三维效应面上直接读取较优工艺条件，可在中心点进行重复实验，具有提高实验的精度、减少试验等特点，已逐步应用于中药提取分离工艺的优化试验设计和分析[14-15]。

表5 膏方煎煮工艺验证试验结果Tab 5 Verification test results of paste decoction process

本研究通过引入星点设计-效应面法对煎煮工艺作精细筛选，以出膏率为评价指标，考察各因素在膏方煎煮过程中的变化趋势，绘制效应面图，实现工艺优选。本研究结果显示，星点设计-效应面法对膏方煎煮工艺优化所得结果更加直观，便于分析，提高了试验精度。采用非线性模型拟合，各项系数的P均<0.05，复相关系数r=0.917 0，提示试验所得的模拟方程是可信的，两个因素对实验结果的影响都是显著，可对膏方煎煮工艺进行预测和分析。经验证，预测值与真实值接近，其相对误差为3.34%(n=3)，确定膏方煎煮工艺为用11.8倍量水煎煮2次，每次煎煮2.4 h，出膏率为46.07%(n=3，RSD=1.43%)，提示星点设计-效应面法优化膏方煎煮工艺准确可行，适宜作为筛选中药煎煮工艺参数研究的试验方法。

出膏率是评价膏方煎煮工艺的基本指标，将其控制在合理的范围内具有一定的意义，但难以满足膏方质量控制标准化[16]。因此，膏方研究将不断深入，在规范膏方制备工艺的基础上，既遵循传统加工理念又引入现代科学技术，通过研究包括外观、口感、流动性、黏度及水溶性等膏方成型性指标和指纹图谱等分析手段，制定精确、全面且可控的综合评价指标，以期构建科学合理化的膏方制备工艺与质量标准体系。