大鼠胃切口缝合后局部注射脂肪间充质干细胞对伤口愈合的影响

杨凡，余小强，华福洲，应俊，王羲凤

作者单位： 342500江西省瑞金，瑞金市人民医院（杨凡、余小强）；南昌大学第二附属医院（华福洲、应俊）；南昌大学第一附属医院（王羲凤）

消化道溃疡是临床常见消化道疾病，我国消化道溃疡发病率为17.32%[1]。消化道穿孔需要手术治疗，虽然大部分可以治愈，但是对老年患者及糖尿病等免疫功能抑制患者，仍会导致愈合不良或吻合口瘘的发生[2]。脂肪间充质干细胞（ADMSC）是一类脐带血组织中分离得到的成体干细胞，能定向分化成骨、脂肪和平滑肌细胞等多种体细胞[3]。此外，ADMSC分泌多种抗炎和免疫抑制因子，如血管内皮增长因子（VEGF）、转化生长因子 1（TGF-1）和胰岛素生长因子等[4]，从而促进组织损伤修复和再生。目前已证实干细胞对修复动物和人的心、脑、肾及肝等脏器损伤具有一定疗效[5-7]，但对消化道伤口愈合疗效有待进一步研究。本研究拟观察采用局部注射ADMSC对大鼠胃切开缝合伤口愈合情况，报道如下。

1 资料与方法

1.1 试剂和仪器 DMEM培养基、青（链）霉素、胰酶-EDTA、胎牛血清（FBS）、转化生长因子（TGF）及磷酸盐缓冲液（PBS）购自美国GIBCO公司；牛血清蛋白（BSA）及DAH染液来自于上海生物工程股份有限公司；I型胶原酶及三硝基苯磺酸购自美国Sigma公司。大鼠ADMSC成脂及成骨诱导分化培养基购于美国Sciencll公司；CD29、CD90及CD45流式抗体购于美国BD公司，ADMSC诱导分化试剂盒购自Invitrogen公司，戊巴比妥钠及一抗（IL-6）购于Abcam公司，二抗（山羊抗兔IgG）购于北京中杉公司。

1.2 动物分组和模型建立 清洁雄性SD鼠（3个月龄），体质量220～260 g，由南昌大学动物部提供，术前适应1d，共36只，通过南昌大学第一附属医院伦理委员会审查。采用随机数字表法将大鼠分为对照组和局部注射ADMSC组（ADMSC组），各18只。两组均予建立胃穿孔缝合手术模型，造模前24 h禁食不禁水，具体实验方法参考文献[8]，ADMSC组用100l的注射器给予缝合口注射注射70l ADMSC（5×106个/只），术后给予正常饮食饮水。

1.3 ADMSC的分离培养和纯化 腹腔注射戊巴比妥钠麻醉并碘伏消毒腹股沟区皮肤后，切取腹股沟区皮下脂肪组织；在无菌操作台内，75%酒精消毒及灭菌PBS冲洗3次后，用眼科剪剪碎脂肪组织；加入0.75%I型胶原蛋白酶37℃震荡消化30 min；过滤去除组织碎片后，1 200 g离心过滤液10 min；低糖DMEM完全培养基（含20%FBS）培养离心后的细胞，培养密度为5×104/cm2，48 h后更换培养液，贴壁的细胞即为ADMSC。ADMSC生长至70%～80%进行传代；第一次传代获得的 ADMSC为第一代（P1）,使用P3～P5进行后续试验。为保持ADMSC的“干性”，本实验仅使用第3～5代ADMSC。

1.4 ADMSC的标记及鉴定 根据国际细胞治疗协会标准鉴定 ADMSC：（1）细胞贴壁生长；（2）细胞表面抗原：将80%P3 ADMSC消化、充分吹打，调整细胞浓度为（1～3）×106/ml；每毫升ADMSC悬液加入CD29、CD90和CD45一抗，使用流式细胞仪检测ADMSC表面抗原阳性率；（3）鉴定ADMSC分化潜能：使用ADMSC诱导分化试剂盒培养诱导ADMSC定向分化成脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞。

1.5 组织病理学分析 胃穿孔缝合后3及5d处死大鼠，盲法评估大鼠胃伤口的修复情况（每组n=6）：取胃伤口组织，甲醛固定，梯度乙醇脱水，包埋切片，苏木素伊红（HE）染色，光镜下评估胃黏膜损伤程度和修复情况。依据常用的1970年 CHIU等报道的病理评分标准，高倍镜下（×400）选取5个非重叠视野，评估胃组织损伤并进行评分。

1.6 组织免疫荧光分析 胃组织经过甲醛固定、脱水、石蜡包埋和切片；包含胃组织的石蜡切片进行脱蜡、抗原修复和血清封闭后，滴加一抗4℃抚育过夜；PBS洗3次后，加二抗室温下抚育半小时；PBS洗3次并加入ABC复合物室温抚育半小时后，加DAB显色。

1.7 统计方法 数据采用SPSS 18.0软件处理，计量资料以均数±标准差表示，采用t检验；计数资料采用2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ADMSC的生物学特性鉴定 ADMSC具有纺锤形态、贴壁生长特点和成脂、成骨的分化潜能，流式细胞分析显示ADMSC对CD29及CD90高表达（封二彩图6a、封二彩图6b），而对CD45低表达（封二彩图6c）。

2.2 胃伤口愈合情况 ADMSC组在术后3及5 d的愈合情况显著好转（封二彩图7），特别是术后第5天愈合情况比对照组显著改善；同时，ADMSC组仅1例发生瘘，对照组5例发生，差异具有统计学意义（2=5.33，P ＜ 0.05）。

2.3 病理评估 对照组胃伤口附近大量炎症细胞浸润，上皮细胞、肉芽生成和血管再生减少。ADMSC组显示更少的中性粒细胞浸润，更多的上皮细胞再生和胶原沉积，特别是术后第5天更显著（封二彩图8）。

2.4 IL-6炎症因子表达 术后3及5d，ADMSC组的IL-6阳性细胞区域占比明显低于对照组。见表1。

3 讨论

ADMSC广泛存在于脂肪组织中，早期Natesan等[9]研究证实，从重度烧伤患者清除的坏死皮肤组织中，每毫升有活力的皮下脂肪组织能够分离得到（1.5～2.5）×105个。ADMSC具有定向分化潜能、促进组织和血管再生、抑制炎症和免疫反应等多种生物学功能[10]。本研究提示：从大鼠腹股沟区脂肪组织提取、分离出ADMSC，具有典型的干细胞相应特征；同时，局部注射ADMSC可显著的降低胃穿孔后缝合伤口的局部炎症反应，减少缝合口瘘的发生率，促进愈合。

表1 两组间术后3及5 d IL-6阳性表达区域占比 %

ADMSC促进消化道器官损伤修复的机制复杂，目前证实其具有“归巢效益”，指ADMSC定向迁移到特定组织内，特别是炎性损伤组织[11]。通过抑制炎症反应、促进组织再生和改善局部微循环等机制发挥作用。ADMSC活化分为体内活化和体外活化[12]。本研究ADMSC体内活化，是通过局部注射ADMSC移植至胃穿孔缝合组组组织周围，在损伤因子（如IL-6）的刺激下活化并发挥抗炎、抑制免疫反应和组织修复等功能[13]；因此，ADMSC的体内活化很大程度上依赖于组织的损伤程度。本研究也发现，胃穿孔缝合处术后3d IL-6显著升高，急性炎症反应显著增强，局部注射ADMSC组早期伤口愈合处IL-6比对照组更高，而术后5 d显著降低，可能与刺激ADMSC在体内活化，从而达到促进组织修复作用。

综上所述，本研究模拟的消化道穿孔修复中，局部注射ADMSC可显著的降低后期的炎症反应，促进创口的愈合。