多指标正交试验优化芪蛭益肺颗粒水提醇沉工艺

王文平 倪健 冷新

摘要：目的 采用多指标正交试验优选芪蛭益肺颗粒的最佳提取及醇沉工艺。方法 以黄芪中黄芪甲苷、葶苈子中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷的提取率及干膏得率为指标，优选芪蛭益肺颗粒的提取工艺；以黄芪甲苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷的保留率为指标，优选最佳醇沉工艺。结果 最佳水提工艺为：加10倍量水，提取1.5 h，共提取3次。最佳醇沉工艺为：浓缩至相对密度1.05～1.10（60 ℃），加乙醇至60%醇沉。结论 本试验优选的水提醇沉工艺稳定可行，可为该制剂生产提供依据。

关键词：芪蛭益肺颗粒；水提醇沉；黄芪甲苷；槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.09.017

中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）09-0071-05

Abstract： Objective To optimize the extraction and alcohol precipitation process of Qizhi Yifei Granules by multi index orthogonal experiment. Methods With extraction rate of astragaloside in Astragali Radix， quercetin-3-O-β-D-glucose-7-O-β-D-gentian diglucoside in Descurainiae Semen Lepidii Semen and yield rate of dry extract as indexes， the extraction process of Qizhi Yifei Granules was optimized. Taking the retention rate of astragaloside and quercetin-3-O-β-D-glucose-7-O-β-D-gentian diglucoside as indexes， the alcohol precipitation process was optimized. Results The best water extraction process was as follows： adding 10 times amount of water， extracting for 1.5 h， 3 times. The optimum alcohol precipitation process was： concentrated to the relative density of 1.05–1.10 （60 ℃）， adding ethanol to 60% and alcohol precipitation. Conclusion The optimized extraction and alcohol precipitation process is stable and feasible， which can provide the basis for the preparation.

Keywords： Qizhi Yifei Granules； water extraction and alcohol precipitation； astragaloside； quercetin-3-O-β-D- glucose-7-O-β-D-gentian diglucoside

芪蛭益肺颗粒为北京中医药大学东直门医院治疗慢性阻塞性肺疾病的经验方，由黄芪、制水蛭、酒黄精、清半夏、浙贝母等10味药组成，具有补气润肺、消肿散结、化痰止咳平喘功效，经临床应用多年，疗效显著。本方重用黄芪补气升阳、行滞通痹，酒黄精补气养阴、健脾、润肺，葶苈子泻肺平喘、利水消肿。原方为汤剂，由于颗粒剂具有性质稳定、生物利用度高、便于工业化生产和携带、服用方便的优点，遂将其开发成颗粒剂。结合文献研究[1-10]，确定制剂工艺为：3味药提取挥发油，其余7味药水提，2份滤液合并后醇沉。

本研究以黃芪中黄芪甲苷和葶苈子中槲皮素-3- O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷及出膏率为指标，采用正交试验法优化芪蛭益肺颗粒处方提取工艺及醇沉工艺，确定芪蛭益肺颗粒在生产中的工艺参数，为制剂生产提供支撑性数据。

1 仪器与试药

Agilent 1260高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），安捷伦1100高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），2000ES蒸发光散射检测器（奥泰公司），HH-S4型电热恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司），KQ5200DA数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），ZDHM型调温电热套（北京中兴伟业仪器有限公司），BT125D型电子分析天平（赛多利斯，0.01 mg），JY5002电子天平（上海衡平仪器仪表厂，0.1 mg）。

黄芪甲苷对照品（批号110781-201515）、槲皮素- 3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷对照品（批号111854-201203），中国食品药品检定研究院；黄芪（批号20160621，北京本草芳源药业有限公司）、制水蛭[批号601102409，北京同仁堂（亳州）饮片有限责任公司]、酒黄精（批号20160518，北京本草芳源药业有限公司）、清半夏（批号20160328，北京本草芳源药业有限公司）、浙贝母（批号20160512，北京本草芳源药业有限公司）、葶苈子（批号20160325，北京本草芳源药业有限公司）、前胡（批号20160510，北京本草芳源药业有限公司），经北京中医药大学刘春生教授鉴定，均符合2015年版《中华人民共和国药典》规定。乙腈、甲醇为色谱纯（Fisher公司），水为娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 黄芪甲苷含量测定

2.1.1 色谱条件

采用Agilent Zorbax SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），乙腈-水（30∶70）为流动相，流速1.0 mL/min，柱温25 ℃。蒸发光散射检测器（ELSD）参数：漂移管温度100 ℃，载气（压缩空气）流速2.7 L/min，進样量10 μL。色谱图见图1。黄芪甲苷峰的保留时间为16.275 min，分离度>1.5，表明此方法可行。

2.1.2 对照品溶液的制备

精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成浓度为0.502 mg/mL的溶液，即得。

2.1.3 供试品溶液的制备

按处方称取饮片9份，各64 g，按L9（34）正交试验安排进行提取，滤液过滤，浓缩定容至1000 mL容量瓶内，摇匀后用250 mL容量瓶精密量取250 mL药液，离心除去不溶于水的杂质，将离心后的上清液浓缩至25 mL，转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇萃取4次，每次40 mL，萃取液用氨试液萃取2次，每次50 mL，弃去氨试液，蒸干，用甲醇复溶，定容至5 mL容量瓶中，测定黄芪甲苷含量[11]。

2.1.4 阴性对照溶液的制备

按处方比例称取除黄芪外的其他药物饮片，按“2.1.3”项下方法制备，即得。

2.2 槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷含量测定

2.2.1 色谱条件

采用Agilent Zorbax SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），乙腈-0.1%醋酸溶液（11∶89）为流动相，流速1.0 mL/min，检测波长254 nm，柱温30 ℃，进样量25 μL。色谱图见图2。槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷峰的保留时间为5.6 min，分离度>2.5，表明此方法可行。

2.2.2 对照品溶液的制备

精密称取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷对照品适量，加30%甲醇制成浓度为0.020 1 mg/mL的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备

按处方称取饮片9份，各64 g，按L9（34）正交试验安排进行提取，滤液过滤，浓缩定容至1000 mL容量瓶内，摇匀后取1 mL，过微孔滤膜，取续滤液，测定提取液中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷的提取率。

2.2.4 阴性对照溶液的制备

按处方比例称取除葶苈子外的其他药物饮片，按“2.2.3”项下方法制备，即得。

2.3 水提工艺优选

2.3.1 正交试验设计

通过查阅文献及对本研究目的的考虑[12-14]，选择加水倍量、提取时间、提取次数三因素，考察加水8、10、12倍量，提取1、1.5、2 h，提取1、2、3次对提取结果影响，采用L9（34）正交表，以黄芪甲苷提取率、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷提取率、干膏得率为考察指标，优选最佳水提工艺，因素水平见表1。

2.3.2 正交试验方法与结果

按处方称取饮片9份，各64 g，按正交试验安排进行提取，取正交试验的9份供试品溶液，分别定容至1000 mL容量瓶中，按“2.1.3”“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，测定黄芪甲苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷提取率。另取正交试验的9份供试品溶液，各精密量取250 mL，置于干燥至恒重的蒸发皿中，蒸干，计算干膏得率。结果见表2，方差分析见表3～表5。

考虑到加权平均法对于各因素判定的主观性[15-16]，本研究采用综合分析各因素优选最佳工艺的方法。综合方差分析结果显示，C因素（提取次数）对槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷的提取率及干膏得率有显著影响（P<0.05），且通过比较2个指标的K值发现，两因素均K3>K2>K1，故提取次数确定为3次；A因素和B因素对3个指标均无显著影响，通过K值比较，对于黄芪甲苷提取率为A3B2C3，对于槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷提取率为A2B2C3，对于干膏得率为A3B3C3，综合考虑生产中的时间成本、资金成本，以及各指标K值，最终确定提取工艺为A2B2C3，即加10倍量水，提取1.5 h，提取3次。

2.3.5 水提工艺验证试验

为进一步考察最佳工艺的准确性和稳定性，按已确定的最优工艺进行3批平行验证试验，结果见表6，表明正交试验确定的最优工艺方案准确、稳定可行。

2.4 醇沉工艺优选

2.4.1 醇沉相对密度考察

影响醇沉的主要因素有药液浓缩相对密度、醇沉浓度[17-20]。预试验显示，用60%乙醇所得指标成分保留率最高。醇沉工艺试验设计如下：称取处方中水提部分黄芪、酒黄精、制水蛭、清半夏、浙贝母、葶苈子、前胡7味药各6个处方量饮片，加10倍量水，加热回流提取3次，每次1.5 h，趁热过滤，合并提取液，冷却备用；称取6个处方量化橘红、当归、连翘3味药，水蒸汽蒸馏法提取挥发油，水液过滤，另器收集，合并上述2份滤液。平行量取滤液4份，每份1700 mL，其中1份作为空白溶液，另3份分别浓缩至相对密度为1.05～1.10、1.10～1.15、1.15～1.20（60 ℃），加入95%乙醇，调节乙醇浓度至60%。冷藏静置24 h后，将沉淀离心，量取上清液体积，取1/10，用旋转蒸发仪蒸干，加水复溶，定容至100 mL容量瓶中，取1 mL，测定其中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷的含量。精密量取1/4醇沉上清液，用旋转蒸发仪蒸干，用25 mL水复溶后测量黄芪甲苷的含量。结果见表7。可见，浓缩至相对密度为1.05～1.10时，指标成分黄芪甲苷和槲皮素-3-O-β- D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷的保留率均最高，故确定醇沉时浓缩液的相对密度为1.05～1.10。

2.4.2 醇沉浓度考察

平行量取上述滤液4份，每份1700 mL，其中1份作为空白溶液，均浓缩至相对密度1.05～1.10，分别用60%、70%、80%乙醇醇沉，结果见表8。可见，60%乙醇醇沉槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷的保留率最高，70%乙醇醇沉黄芪甲苷的保留率最高，60%醇沉和70%醇沉的黄芪甲苷保留率无明显差异，另结合大生产及文獻研究[21-25]，选择醇沉浓度为60%。

2.4.3 醇沉工艺验证试验

称取处方量药材，按照优选的水提醇沉工艺进行3批验证试验，结果见表9。结果显示，3批验证试验数据稳定，确定醇沉工艺为浓缩至相对密度1.05～1.10，60%乙醇。

3 讨论

本研究以黄芪甲苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7- O-β-D-龙胆双糖苷的提取率及干膏得率为指标，采用正交试验设计优化芪蛭益肺颗粒的提取工艺，最终确定最优提取工艺为加10倍量水，提取1.5 h，共提取3次。3批验证试验显示提取工艺准确，稳定可行。另外，以黄芪甲苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷的保留率为指标，最终确定芪蛭益肺颗粒的最优醇沉工艺为浓缩至相对密度为1.05～1.10，用60%乙醇醇沉。3批验证试验显示醇沉工艺稳定可行。

本处方药味众多，若以单一成分作为评价指标，不能保证颗粒整体质量，故本试验选取3个指标优选提取工艺，以确保提取工艺的准确性和可靠性，考虑到加权评分的主观性，未采用加权评分法，而是根据每个指标的正交试验结果进行综合分析，确定最佳提取工艺。本研究数据可用于指导制剂生产。

2015年版《中华人民共和国药典》规定，葶苈子含量测定的指标成分为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7- O-β-D-龙胆双糖苷，而文献报道以此成分作为正交试验指标的研究很少，本研究可为葶苈子在生产中的提取及醇沉工艺提供参考依据。

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（收稿日期：2017-12-06）

（修回日期：2017-12-26；编辑：陈静）