左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症大鼠海马神经元病理形态及凋亡的影响

柳卓 孟盼 杨蕙

摘要：目的 觀察左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症（diabetes mellitus with depression，DD）大鼠海马神经元病理形态的影响，探讨其保护作用机制。方法 采用尾静脉注射链脲佐菌素联合慢性应激建立DD大鼠模型。72只SD大鼠随机分为正常组、模型组、阳性药组和左归降糖解郁方低、中、高剂量组，每组12只，分别给予相应药物。末次给药后，检测大鼠血糖及行为学变化，分别采用HE染色、尼氏染色、高尔基染色观察大鼠海马组织病理形态，免疫组化检测大鼠海马Caspase-3的表达。结果 与正常组比较，模型组大鼠血糖显著升高，海马区神经元数量显著减少，神经元凋亡增加，神经元胞体出现变形、树突棘减少等病理损伤情况；给予左归降糖解郁方干预后，模型大鼠高血糖和抑郁样状态缓解，海马神经元数量显著增加，神经元形态基本恢复正常，左归降糖解郁方高、中剂量组Caspase-3表达较模型组明显降低。结论 左归降糖解郁方可明显改善DD大鼠血糖和学习记忆能力，其机制可能与减缓海马损伤和凋亡、恢复神经元数量与形态有关。

关键词：左归降糖解郁方；糖尿病并发抑郁症；海马神经元；病理形态；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.09.011

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）09-0044-05

Abstract： Objective To observe the effects of Zuogui Jiangtang Jieyu Prescription （ZGJTJYP） on pathological morphology of hippocampal neurons in rats of diabetes mellitus with depression （DD）； To discuss its protective mechanism of action. Methods DD rat model was established by tail vein injection of STZ combined with chronic stress. Totally seventy-two SPF rats were randomly divided into normal group， model group， positive medicine group， ZGJTJYP low-， medium-， and high-dose groups， with 12 cases in each group， and were given corresponding medicine. After the last administration， blood glucose and behavioral changes were measured in each group. HE staining， Nissl staining， and Golgi staining were used to observe the changes of pathological morphology in rat hippocampus. The expression of Caspase-3 in hippocampus was detected by immunohistochemistry. Results Compared with the normal group， blood glucose level was significantly increased in the model group； the number of neurons in the hippocampus decreased in the model group； the apoptosis increased in the model group； the neuronal soma showed deformation and reduced dendritic spines and other pathological damages in the model group. After intervention of ZGJTJYP， hyperglycemia and depression-like status of the model rats were relieved； the number of hippocampal neurons increased significantly； neuronal morphology basically returned to normal. The expressionof Caspase-3 in ZGJTJYP high- and medium-dose groups was significantly lower than that in model group. Conclusion ZGJTJYP can significantly improved blood glucose and learning and memory abilities in DD rats， which may be related to slowing hippocampal injury and apoptosis， and restoring neuronal quantity and morphology.

Keywords： Zuogui Jiangtang Jieyu Prescription； diabetes mellitus with depression； hippocampal neuron； pathological morphology； rats

糖尿病并发抑郁症（diabetes mellitus with depression，DD）是糖尿病患者最易并發的疾病之一，我国约51%糖尿病患者存在不同程度的抑郁症状。研究表明，DD患者自杀的危险性高达10%，远高于普通人群的0.01%～0.03%[1]。然而，DD确切的发病机制至今尚未完全阐明。课题组前期研究发现，海马是DD发生发展的关键靶器官，DD大鼠存在海马萎缩、凋亡等情况[2]。左归降糖解郁方有滋阴益气、化瘀解郁的功效。课题组前期研究显示，左归降糖解郁方能缓解海马星型胶质细胞增生紊乱，从而改善大鼠学习记忆功能[3]。糖尿病患者脑内海马谷氨酸含量升高，谷氨酸堆积并释放到细胞外可引起海马的神经兴奋性毒性，进而造成海马损伤并导致抑郁发生。本课题组前期采用皮质酮和高浓度糖皮质激素成功建立了DD动物模型[4]，本实验在此基础上，采用HE染色、尼氏染色、高尔基染色和免疫组化方法观察左归降糖方对DD大鼠海马神经元病理形态的影响，探讨其保护作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级SD雄性大鼠72只，体质量190～230 g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号SCXK（湘）2013-0004。饲养于湖南中医药大学第一附属医院SPF级动物房，温度（25±1）℃，相对湿度40%～60%，自由摄食饮水，实验前适应性饲养3 d。

1.2 药物

左归降糖解郁方（姜黄9 g，牛膝9 g，丹参12 g，枸杞子12 g，山萸肉12 g，贯叶连翘3 g，黄芪18 g，牡丹皮6 g，熟地黄15 g，菟丝子9 g，杜仲9 g），饮片购自湖南中医药大学第一附属医院中药房，由制剂室监制；盐酸二甲双胍片，湖南湘雅制药公司，批号150123；盐酸氟西汀胶囊，加拿大Patheon公司，批号SS41A。

1.3 主要试剂与仪器

One Touch Ⅱ血糖仪及血糖试纸（美国强生公司），尼氏染色液（上海博谷生物科技有限公司），高尔基染色试剂盒（美国Genmed公司），Caspase-3抗体（美国Abcam公司），二抗试剂盒（中杉金桥），DAB试剂盒（中杉金桥），苏木素（中杉金桥），封闭液（中杉金桥）。Morris水迷宫（北京智鼠多宝生物科技有限责任公司），DVP-W7显微镜图像处理系统（日本Olympus公司），Olympus生物显微镜（日本Olympus公司）。

2 实验方法

2.1 分组、造模和给药

高脂饲料灌胃联合小剂量链脲佐菌素（38 mg/kg）尾静脉注射，连续14 d，选取空腹血糖≥16.00 mmol/L大鼠作为糖尿病模型大鼠。随机分为模型组、阳性药组和左归降糖解郁方高、中、低剂量组（中药高、中、低剂量组）。继续给予慢性不可预见性应激，应激方法包括4 ℃冰水浴、45 ℃热水浴、昼夜颠倒、倾笼等，每日采用1种刺激并不连续出现，期间大鼠均孤笼饲养[5]。中药高、中、低剂量组分别予左归降糖解郁方20.53、10.26、5.13 g/kg水煎液，阳性药组大鼠给予盐酸二甲双胍0.18 g/kg+氟西汀1.8 mg/kg，空白组和模型组给予生理盐水。给药体积均为10 mL/kg，每日1次，连续28 d。

2.2 血糖测定

动物禁食不禁水8 h，剪去大鼠尾尖取血，使用血糖仪测定血糖并记录。

2.3 Morris水迷宫实验

实验共进行5 d。第1～4日在水面下放置一个平台，按逆时针方向将大鼠面向池壁放入水中，观察并计时90 s。大鼠寻找并爬上平台的时间为逃避潜伏期，如大鼠未找到平台则记为90 s。第5日撤去平台，观察并记录大鼠进入目标象限的时间。

2.4 海马组织病理形态观察

每组取6只大鼠，末次给药后12 h，禁食24 h，10%水合氯醛4 mL/kg腹腔麻醉，用输液器快速灌注200 mL生理盐水，再用4%多聚甲醛灌注，直至无血液流出，尾部及四肢均僵硬，断头取脑。将标本固定于10%固定液中。

2.4.1 HE染色

标本置于固定液中固定24 h，0.01 mol/L PBS浸泡12 h，脱水，石蜡包埋，切片，染色后脱水并用中性树胶封片，于光学显微镜下观察、拍照。

2.4.2 尼氏染色

氯仿中冰冻切片1 min，空气中放置1～2 d自然晾干，梯度乙醇脱水，37 ℃温箱中尼氏染色10 min，蒸馏水洗涤，95%乙醇分色，脱水，透明，封片。

2.4.3 高尔基染色

大鼠麻醉后，双蒸水去血渍后将脑组织浸泡于媒染液（浓甲醛、蒸馏水、水合氯醛、重铬酸钾），避光放置3 d。1%硝酸银浸泡镀银，连续3 d换银液并置暗处3 d。切片，漂洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

2.4.4 免疫组化检测

常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，切片（厚度5 μm）。脱蜡后加3%H2O2室温反应20 min，PBS清洗。血清工作液封闭15 min后加Caspase-3抗体（1∶50），4 ℃过夜。隔日取出30 min恢复室温后，PBS 冲洗5 min×3次。滴加二抗试剂盒，反应20 min。冲洗，DAB染色，苏木素复染后用中性树胶封片。高倍镜下拍摄，采用Image Pro软件分析积分光密度（IOD）。

3 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，当数据满足正态性且组间方差齐时采用方差分析；如不满足则用非参数检验法。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 Morris水迷宫实验结果

与空白组比较，模型组大鼠逃避潜伏期明显延长，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，阳性药组和中药高剂量组大鼠逃避潜伏期明显缩短，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表1。

4.2 左归降糖解郁方对模型大鼠空腹血糖的影响

与空白组比较，模型组大鼠血糖显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，阳性药组和中药高、中剂量组大鼠血糖明显降低，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结果见表2。

4.3 HE染色结果

正常组大鼠海马神经元形态规则，排列整齐，染色质均匀，神经元间隙正常；模型组大鼠海马神经元胞体肿胀，核固缩，胞浆浓缩深染，呈一定的空泡状，神经元之间排列紊乱无序，间隙拉长；阳性药和中药高剂量组大鼠海马空泡细胞数明显减少，神经元损伤程度明显减轻并且排列趋于整齐。见图1。

4.4 尼氏染色结果

正常组大鼠海马尼氏染色可见神经元呈块状或颗粒状，排列整齐、紧凑；模型组大鼠海马神经元排列散乱，分布较稀疏，细胞带出现断裂，存活细胞数显著减少，大量神经元出现尼氏体碎裂，胞质淡染，核变小。与正常组比较，模型组大鼠海马存活神经元数量显著减少（P<0.05）；阳性药组和中药高剂量组大鼠海马神经元排列尚整齐，但细胞间隙增宽，少量神经元可见尼氏体碎裂，胞质中央尼氏小体消失；与模型组比较，阳性药组和中药高、中剂量组大鼠海马存活神经元数量显著增加（P<0.05，P<0.01）。见图2、表3。

4.5 高尔基染色结果

正常组大鼠海马神经元胞核清晰且形态规则，第二、三级树突棘排列密集整齐；模型组大鼠海马区神经元胞体变形，部分神经元消失，形成不规则状空泡，胞间间隔增大，未见明显的银染树突棘；阳性药组和中药高剂量组可在一定程度上逆转大鼠海马锥体细胞胞体的形态结构损伤、恢复树突复杂性和可塑性，而中药中、低剂量组仅能略恢复神经元的数目和排列整齐度。见图3。

4.6 左归降糖解郁方对模型大鼠海马Caspase-3蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠海马区Caspase-3蛋白表达IOD值明显增加（P<0.01）；与模型组比较，阳性药组和中药高、中剂量组大鼠海马Caspase-3蛋白表达明显降低（P<0.05，P<0.01）。见图4、表2。

5 讨论

临床研究表明，糖尿病患者存在不同程度的认知功能障碍，而海马与认知功能密切相关，是学习、记忆的重要解剖部位和神经中枢，海马结构和功能损伤是抑郁症患者最常见的病理变化[6]。课题组前期实验发现，DD模型大鼠出现认知功能下降[7]。左归降糖解郁方由张景岳左归饮加减而来，方中以熟地黄为君药，山萸肉、枸杞子为臣药，共奏滋养肾阴之功效，佐以菟丝子、牛膝和杜仲补肝肾，黄芪益气健脾，丹参、牡丹皮活血化瘀，加入姜黄、貫叶连翘以化瘀行气、疏肝解郁，全方有滋阴益气、化瘀解郁的功效。前期实验表明，左归降糖解郁方能明显改善DD大鼠血糖血脂代谢紊乱和抑郁样行为，并可延缓海马损伤的发展[8-10]。

HE染色结果显示，阳性药及高剂量左归降糖解郁方可改善模型大鼠海马神经元核固缩等状况。尼式小体是结构蛋白和分泌蛋白的合成中心，当神经元受到损害，尼式小体逐渐分解以至消散。尼氏染色结果显示，相比DD状态下大鼠海马神经元存活细胞数的减少，各给药组海马存活神经元数量显著增加。提示左归降糖解郁方有减轻DD大鼠脑组织神经元病理形态学改变、修复神经元损伤的作用。高尔基染色是一种准确、可靠的神经组织染色。高尔基染色结果显示，阳性药及高剂量左归降糖解郁方在一定程度上逆转DD模型大鼠海马区神经元呈现不规则空泡及部分神经元消失。说明左归降糖解郁方有修复突触形态的作用。

Caspases是哺乳动物细胞凋亡的启动者和执行者，Caspase-3是Caspases级联“瀑布”下游最关键的凋亡蛋白酶，Caspase-3是对细胞凋亡具有关键作用的蛋白质。本实验结果显示，模型组Caspase-3蛋白表达明显升高，表明DD大鼠海马神经元存在凋亡，中药高、中剂量组Caspase-3蛋白表达较模型组明显减少，可见左归降糖解郁方可明显缓解凋亡情况。

综上所述，左归降糖解郁方可改善DD大鼠血糖和学习记忆能力，其作用可能与减缓海马损伤、恢复神经元数量与形态有关，其调控细胞损伤的机制有待进一步研究。

参考文献：

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[3] 张秀丽，王宇红，杨蕙，等.左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症模型大鼠学习记忆及海马超微结构的影响[J].时珍国医国药，2015，26（4）：787-789.

[4] 柴上.糖尿病并发抑郁症大鼠海马神经元凋亡机制的研究及中药干预[D].长沙：湖南中医药大学，2015.

[5] 孟盼，赵洪庆，杜青，等.左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症大鼠海马神经元凋亡的影响[J].中国中医药信息杂志，2016，23（9）：78-81.

[6] KHAN， S A， RYALI V，BHAT P S， et al. The hippocampus and executive functions in depression[J]. Ind Psychiatry，2015，24（1）：18-22.

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[10] 凌佳，杨琴，刘检，等.左归降糖解郁方对模拟糖尿病并发抑郁症环境下模型大鼠海马神经元凋亡相关蛋白的影响[J].中国中医药信息杂志， 2017，24（10）：35-39.

（收稿日期：2018-03-13）

（修回日期：2018-04-03；编辑：华强）

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