一株苹果树腐烂病病原菌的分离与初步鉴定*

豆雅楠 牛世全 豆建涛 赵 丹郑豆豆 周 璇 王 彦 孔维宝 朱学泰

（西北师范大学生命科学学院 甘肃兰州 730070）

苹果树腐烂病是世界范围内危害苹果树最为严重的真菌性植物病害之一［1］，在我国主要苹果产区均有发生，且危害严重。目前，对于苹果树腐烂病的研究已有一些进展：2014年，薛应钰等［2］对甘肃省12个县区23个乡镇的74个苹果园进行了苹果树腐烂病的发生和防治情况调查，结果表明在所调查的4 011株苹果树中，总体发病率为41.09%，庆城、镇原和庄浪果园的果树发病率较高，且镇原果园的果树发病最为严重，病情指数为42.18；臧睿等［3］研究了分离自陕西的61株苹果树腐烂病菌（Cytosporaspp.）的生物学特性及致病性，实验结果表明，陕西省苹果树腐烂病菌具有多样性、致病性分化现象和复杂性；王旭丽［4］通过对我国河北、河南、陕西、甘肃等9个省、23个市、县的150个苹果树腐烂病分离株的形态学、培养性状的观察和对ITS序列的分析及人工条件下致病性试验，明确了该病在我国的种类和优势类群，分析了苹果树腐烂病菌的遗传分化规模，探讨和比较了各病菌的表型差异和不同分离株在非自然条件下的致病性差异；孙广宇［5］等研究了苹果树腐烂病发生程度与树体营养之间的关系，以期为苹果树腐烂病的防治提供理论指导，结果表明树体营养水平与苹果树腐烂病发生程度有明显相关性。

甘肃省作为黄土高原苹果生产的优势产区，同时也是北方苹果生产大省，苹果产业已成为甘肃省的区域特色优势产业和名副其实的农民增收致富产业，发展潜力巨大［6-7］。但近年来，随着产业结构的调整和种植面积的扩大，苹果树腐烂病在各苹果产区普遍发生，且有不断蔓延之势，已成为威胁我省苹果产业安全健康和可持续发展的主要制约因素。该病主要发生在成龄的结果树上，危害枝干皮层并引起腐烂症状，受侵染皮层产生红褐色软腐症状同时散发酒糟味。

为了明确甘肃省镇原县苹果病区腐烂病的发病机理，采用病原菌分离和离体枝条接种法对甘肃省镇原县产区的苹果树腐烂病致病性进行检测，结合形态学和分子生物学鉴定手段对该病病原菌种类及其分类地位做进一步确认，以期为进一步研究苹果树腐烂病的生物防治提供新的手段。

1 材料与方法

1.1 供试材料 2016年4月采自甘肃省镇原县苹果种植园有明显腐烂症状的病枝。

1.2 实验方法

1.2.1 病原菌的分离与纯化 采用组织分离法［8］（图1）。

图1 病原菌的分离纯化路线图

1.2.2 致病性检测 依据菌落形态特征，将初步鉴定的菌株用于回接致病性实验。采用离体枝条接种法［9］（图2），将 4℃冰箱中保存的菌株移至PDA活化后，制成菌饼用于后续实验。

图2 病原菌致病性检测路线图

1.2.3 病原菌培养性状描述和形态鉴定 将初分离与再分离得到的菌株分别接种在PDA培养基上，在28℃恒温倒置培养5 d后，观察菌落形态特征。待菌丝生长成熟后，显微镜下观察分生孢子形态特征，参照相关资料［10］，进行分类学鉴定。

1.2.4 病原菌分子生物学鉴定 病原菌基因组DNA提取与rDNA-ITS区PCR扩增，将分离得到的菌株接种在PDB培养基中，28℃振荡发酵培养3～4 d。离心沉淀，取菌丝体，加入TE缓冲液，煮沸法提取DNA。用真菌rDNA-ITS通用引物ITS1和ITS4（表1）对rDNA-ITS区段进行PCR扩增。PCR反应体系（30 μL）：Taq DNA 聚合酶 15 μL，引物各1 μL，ddH2O 9 μL。 PCR 扩增程序如表2 所示。

表1 真菌通用引物及序列

表2 PCR扩增程序

病原菌rDNA-ITS序列测序及系统发育树构建，PCR扩增得到的产物送华大基因公司测序，测序结果与GenBank数据库已知序列进行同源性比对分析，采用MEGA6软件构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 病害症状特征 腐烂病主要危害枝干皮层引起腐烂症状，枝条染病后表现为病斑部位隆起，有酒糟味，发病后期病斑处失水干瘪，下陷，之后病斑部位着生许多黑色小点为病菌的分生孢子器。

2.2 病原菌的初步分离和致病性检测 对采自甘肃省镇原县苹果产区3个采样点的病原菌分离结果显示：通过组织分离法分离到的菌株为同一菌株（图3）；在PDA培养基上目标菌株的菌落呈雪花状，菌背白色或深褐色，气生菌丝稀少（图4）。依据科赫法则采用离体枝条接种法将所分离菌株接种于健康枝条，观察病斑产生情况，记录病斑直径，以只接种空白PDA菌饼且在观测期内未发病为对照，结果显示：病原菌在接种10 d后病斑迅速扩展，病斑大小超出菌饼边缘，病斑深褐色溃疡状，随着时间的延长，病斑面积不断扩大，直至侵染整个枝条（图5）；重新分离枝条病组织部位的致病菌株，分离结果显示该菌株重新分离的概率为100%。

图3 病原菌分离结果

图4 病原菌菌落形态

图5 菌株P1离体枝条致病性测定结果

2.3 病原菌的鉴定 菌株P1显微形态特征结果显示菌落初为乳白色、后期为黄褐色，雪花状、菌背白色或深褐色，气生菌丝稀少。子囊孢子单细胞，无色，香蕉形，分生孢子单孢，无色，香蕉形。

通过对供试菌株的rDNA-ITS序列分析，其序列长度为594 bp（图6），将供试菌株的序列通过BLAST与GenBank核酸数据库中已知序列进行同源性比对，并用MEGA6软件构建系统发育树（图7），结果显示菌株P1与分离自新疆石河子苹果树皮的病原菌黑腐皮壳菌（V.mali）（KT934353）聚于同一分支。综合显微形态特征、菌落形态以及ITS基因序列分析结果，初步确认菌株P1为黑腐皮壳菌（V.mali）。

图6 病原菌的DNA电泳图

图7 基于ITS基因序列构建的系统发育树

3 讨论

黑腐皮壳属（valsa）属于子囊菌门，它们大多为死体营养物，既能寄生、又能腐生，一般在寄主的叶、枝干、果上形成明显的病斑，并在发病部位产生各种颜色的霉状物或小黑点等特征［11］。其所致病害的种类较多，很多是重要的经济作物病害，可导致多种果树的腐烂病。已有的研究结果显示［9］子囊菌门苹果黑腐皮壳菌的2个变种，即V.malivar.mali和V.malivar.pyri.是引起我国梨和苹果腐烂病的主要病原菌；张旭业［12］等研究表明甘肃省苹果树腐烂病菌有2个种，分别为V.mali和Valsa malicola，其中V.mali有2个变种，分别为V.malivar.mali和V.malivar.pyri.Valsa leucostoma和Valsa cincta引起北美、欧洲的桃树腐烂病，此外有研究结果显示［13］，桃树腐烂病菌除侵染桃树外，还可侵染杏、油桐、樱桃、花椒等。目前，对苹果树腐烂病致病菌的研究显示，我国苹果树腐烂病的主要致病菌是V.mali［13-14］，与本研究结果一致。

依据不同的病害类型，植物病原菌的致病性检测方法也因此而不同，而腐烂病致病菌测定多采用离体枝条接种法［15-16］，近些年也出现一些更为简便的验证方法，例如韦洁玲［17］、日本学者 Abe［18］等研究发现以嫩梢、完全展开叶作为接种材料，材料本身均一性较好，误差小，鉴定结果稳定，相比于离体枝条接种烫伤程度、深浅、面积难以保持一致和枝条烫伤时间长短、水含量不同等问题，其可作为快速、准确评价苹果树腐烂病菌致病性的方法。本实验结合改进的离体枝条接种法对所分离到的菌株进行二次回接鉴定，以重新分离菌株与原菌株一致为原则，最终得到了甘肃省镇原县的1株苹果树腐烂病的致病菌株（P1），结合形态特性和产孢形态以及系统进化分析综合得出菌株P1 为黑腐皮壳菌（V.mali）。

原有的对苹果树腐烂病致病菌的鉴定主要依据经典分类学方法，由于目前尚无人对甘肃省镇原县苹果产区苹果树腐烂病的病原菌种类组成和致病性问题进行系统研究且通过经典的分类学方法对其鉴定具有一定的局限性和不确定性，而分子手段却能弥补传统分类学方法的不足和缺陷，其中真菌的ITS序列具有极为广泛的序列多态性，常用于近缘物种的系统发育关系分析、菌种鉴定和种群遗传分化研究，成为真菌鉴定的重要手段［19］。

目前针对苹果树腐烂病害已开展了一些生物防治工作，杨燕等［20］利用多羟基双萘醛（Polyhydroxy dinaphthalde）提取物（WCT）研究了该植物源抗病毒复制抑制剂对苹果树腐烂病病原菌菌丝的生长抑制情况，以及对苹果树腐烂的防治效果，结果表明WCT对苹果腐烂病菌具有一定的抑制作用和诱导寄主产生抗性的作用；王卫雄等［21］从果园土壤和苹果树枝条上分离到2株细菌，该菌对苹果树腐烂病具有很好的拮抗作用，且离体枝条防效测定表明生防菌原液防效最高，分别为74.43%和 77.07%；薛应钰等［22］从苹果树根际土壤中分离到一株对苹果树腐烂病具有很高抑制率的放线菌，离体枝条防效试验表明，该菌发酵原液对苹果树腐烂病防效可达75%以上；张清明等［23］分离到了一株来自于健康苹果树枝条的拮抗放线菌卡伍尔链霉菌 （Streptomyces cavourensis）A-2，研究结果显示其无菌发酵滤液对苹果树腐烂病的抑制率高达95%以上。

本研究室长期从事极端环境资源微生物的相关研究，该生境下微生物易产生适应高盐、高碱环境的特殊代谢产物和活性物质，形成特殊的生理机制，具有重要的应用价值。王蓓等［24］从甘肃省河西走廊盐碱土中分离出较多对立枯丝核菌有较强生长抑制的生防放线菌，这些拮抗菌株对供试病原菌的生物防治有重要的应用价值；耿晖［25］等从河西走廊盐碱土壤中分离筛选出一株对黄芪根腐病有强生防功能的放线菌株DA4-4-1，经鉴定其为链霉菌属蓝紫链霉菌，为黄芪根腐病的田间生物防治提供新的手段。

目前本研究室正从敦煌地区盐碱土壤中筛选获得具有生防功能的芽孢杆菌，以期为苹果树腐烂病的生物防治提供新的手段。在植物病害中，70%～80%的病害是由病原真菌的侵染所致且部分病原真菌侵染农作物时可分泌对人畜及环境有害的毒素和代谢物，对农产品的安全性及生态环境构成极大威胁［26］，故本研究结果为后续苹果树腐烂病的生物防治工作提供了新的手段。