金钱草中多酚超声辅助提取工艺优化及其抗氧化活性

楚红英， 罗 晓， 李 瑜

(1.黄河水利职业技术学院环境与化学工程系，河南开封 475004； 2.河南中医药大学，河南郑州 450003；3.郑州颐和医院泌尿外科，河南郑州 450047)

金钱草为报春花科珍珠菜属植物过路黄的新鲜或干燥全草[1]，全草供药用，有清热利尿、祛风止痛、止血生肌、消炎解毒、杀虫之功效[2]，可治急慢性肝炎、黄疸型肝炎、胆囊炎、肾炎、细菌感染、尿路结石、泌尿系统感染、扁桃腺炎、口腔炎、痈疔疗毒、毒蛇咬伤、乳痈、痢疾、疟疾、肺出血、小儿疳积、荨麻疹等疾病[3-6]。金钱草含有黄酮类、酚类、苷类、内脂类、鞣质、挥发油、氨基酸、胆碱、甾醇、氯化钾等成分[7-8]。对植物中酚类化合物进行定量测定，国内外常用的方法有高锰酸钾滴定法、酒石酸亚铁分光光度法、Folin-Ciocalteu-分光光度法、铁氰化钾分光光度法、香草醛法、原子吸收分光光度法、化学发光法、高效液相色谱法等方法[9-15]。本试验用溶剂超声辅助对金钱草中的多酚进行提取，以没食子酸作为标准品，用酒石酸亚铁分光光度法对金钱草中多酚测定进行探讨。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

本试验所用的金钱草购于某医药大厦。

主要试剂：没食子酸标准品(纯度≥98%)，购自Sigma-Aldrich公司；其他试剂均为分析纯，试验用水为2次蒸馏水。

主要仪器：PB1502-L梅特勒分析天平，购自瑞士梅特勒公司；医用数控超声波清洗器，购自江苏省昆山市超声仪器有限公司；恒温干燥箱，购自上海智诚分析仪器制造有限公司；水循环真空泵，购自河南智诚科技有限公司；倾斜式高速万能粉碎机，购自北京中兴伟业仪器有限公司制造；V-1200型可见分光光度计，购自上海美谱达仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的绘制 准确称取干燥的没食子酸0.250 0 g溶解后转移到250 mL容量瓶内定容。分别移取没食子酸标液0、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00 mL于10 mL容量瓶中，用蒸馏水补至2 mL，加入2 mL酒石酸亚铁溶液，用磷酸缓冲溶液定容，放置30 min，在D540 nm处测其吸光度[16]，以没食子酸标准系列溶液的浓度为横坐标，以对应的吸光度为纵坐标，绘制出标准曲线。线性回归方程为y=0.109 4x+0.025 9，r=0.999 8(n=6)，浓度在0～2.00 g/L范围内线性关系较好。

1.2.2 金钱草中多酚的提取 将金钱草依次用自来水、蒸馏水洗净之后，在100 ℃烘干至恒质量，粉碎，用20目筛子过筛，密封保存于棕色瓶中备用。称取一定量的金钱草粉末于锥形瓶中，按要求加入提取剂，在一定条件下进行超声提取，提取功率为300 W，抽滤，在旋转蒸发仪上浓缩，将滤液定容至50 mL容量瓶中作为待测试样。

1.2.3 样品中多酚含量的测定 准确吸取待测试样 2.00 mL 于10 mL容量瓶中，加入2.00 mL酒石酸亚铁溶液，用磷酸缓冲溶液定容至10 mL，在D540 nm处测定吸光度，根据回归方程计算多酚含量。

1.2.4 金钱草多酚体外抗氧化活性

1.2.4.1 DPPH·清除能力测定 取1 mL不同浓度的金钱草多酚提取液，分别加入盛有2.00 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液的试管中，25 ℃下避光放置30 min，于517 nm处测其吸光度Di；2.00 mL DPPH溶液加2.00 mL无水乙醇的吸光度Dc，2.00 mL金钱草多酚溶液和2.00 mL无水乙醇吸光度为Dj[17-19]，按式(1)计算清除率：

(1)

1.2.4.2 ·OH清除率测定 在试管中依次加入9 mmol/L硫酸亚铁铵、9 mmol/L水杨酸-乙醇各1.00 mL，分别加入不同浓度的金钱草多酚试液1.00 mL，0.03 mL 8.8 mmol/L双氧水，以蒸馏水作空白对照，维生素C作阳性对照，于37 ℃下反应30 min，于510 nm处测定吸光度Dx，空白对照D0，样品本底吸光度Dx0用蒸馏水代替双氧水。按式(2)计算清除率[17-19]。

(2)

(3)

1.2.4.4 脂质体系中抗氧化能力测定 在试管中依次加入1mL LLS(300 mg卵磷脂溶于30 mL pH值7.4的10 mmol/L磷酸缓冲液)、1 mL 400 mmol/L FeCl3、1 mL样品、1 mL三氯乙酸(TCA)-硫代巴比妥酸(TBA)-盐酸(HCl)混合液，避光沸水煮15 min，迅速冷却，离心取上清液在532 nm处测吸光度Ds，以1 mL蒸馏水为空白对照测吸光度Dc[17-19]。按式(4)计算脂质体系的抑制率。

(4)

2 结果与分析

2.1 单因素试验

试验以 1.0 g 金钱草作为提取对象，确定多酚初始提取工艺参数为：液料比30 mL ∶1 g；提取温度40 ℃，提取时间 30 min，丙酮体积分数30%，按“1.2.2”节的方法提取多酚。试验过程中，固定其他3个因素，变化其中1个因素，分别对提取温度、液料比、丙酮体积分数、提取时间4个因素进行单因素探索，以考察各因素对金钱草多酚提取率的影响。

2.1.1 提取温度对多酚提取率的影响 由图1可知，随着提取温度的升高，多酚物质的提取率先增加后降低，在50 ℃时多酚提取率达到13.2 mg/g，此后随着温度增加，多酚提取率呈现降低趋势，可能是随着温度的升高，丙酮挥发加快，金钱草中多酚类物质不能被充分溶解，因此多酚提取率下降较快。

2.1.2 液料比对多酚提取率的影响 液料比是影响多酚提取率的重要因素之一，适当的液料比不仅能使原料中的多酚物质得到充分提取，而且可减少溶剂的浪费和节省提取成本。由图2可知，随着液料比的增加，多酚提取率逐渐增加，当液料比为30 mL ∶1 g时，多酚提取率为13.0 mg/g，随后液料比增加，提取率基本保持平稳，考虑到液料比越大成本越高，故宜选用液料比为30 mL ∶1 g。

2.1.3 提取时间对多酚提取率的影响 由图3可知，随着提取时间的增加，多酚物质的提取率也在增加，当时间超过 40 min 以后，提取率增加幅度不大，故适宜的提取时间应在40 min左右。

2.1.4 丙酮体积分数对多酚提取率的影响 由图4可知，随着丙酮体积分数的升高，多酚的提取率增加，当丙酮体积分数为80%时，多酚提取率达到13.5 mg/g，此后丙酮体积分数增加，多酚提取率呈现降低趋势。这可能是由于其他物质的溶解，降低了多酚的溶解度。

2.2 正交试验设计

试验选择丙酮体积浓度、液料比、提取时间、提取温度为考察因素，分别确定3个水平进行试验，采用L9(34)正交设计表安排，每个试验号重复3次，取其平均值，正交设计及结果见表1。

表1 金钱草中多酚类化合物提取正交试验设计及结果

上述试验结果表明，各影响因子的主次关系为液料比=丙酮体积分数>提取温度>提取时间，最佳方案为A2B2C3D2(即提取温度40 ℃，液料比30 mL ∶1 g，提取时间50 min，丙酮体积分数60%)。按A2B2C3D2条件下重复测定5次，多酚的提取率分别为17.45、16.91、17.64、16.98、17.68 mg/g，平均值为17.33 mg/g，相对标准差RSD为2.09%。

正交试验的方差分析旨在研究各因素对多酚提取率的影响程度。由表2可知，液料比对试验结果影响极显著；丙酮体积分数对试验结果影响显著；提取温度、提取时间对试验最后结果影响较小。

2.3 多酚抗氧化结果分析

测定多酚抗氧化时，均以相应浓度的维生素C作阳性对照。

2.3.1 金钱草多酚对DPPH·的清除能力 由图5可知，在试验浓度范围内，随着金钱草多酚浓度的增加，DPPH·的清除能力增强，但金钱草多酚的清除率不及维生素C的清除率。当金钱草多酚浓度为50 μg/L时，对DPPH·的清除率达到20.6%，等浓度的维生素C对DPPH·的清除率达到85.2%；当金钱草多酚浓度为500 μg/L时，DPPH·的清除率达到68.3%，等浓度的维生素C对DPPH·的清除率达到98.8%。

表2 正交试验设计结果方差分析

注：*、**分别表示不同处理对试验结果影响显著、极显著。

2.3.2 金钱草多酚对·OH清除率的测定 由图6可知，在试验浓度范围内，对·OH的清除能力随着金钱草多酚浓度的增加而增加，但其对·OH的清除能力不及维生素C。当金钱草多酚浓度为50 μg/L时，对·OH的清除率达到31.3%，等浓度的维生素C对·OH的清除率为76.7%；当金钱草多酚浓度为500 μg/L时，对·OH的清除率达到87.6%，维生素C在此浓度下对·OH的清除率达99.8%。

2.3.4 金钱草多酚还原能力的测定 由图8可知，随着金钱草多酚及维生素C浓度的增加，吸光度逐渐增大，也就是说Fe3+还原能力随着多酚及维生素C浓度的增加越来越强；且等浓度多酚还原能力不及维生素C强。

2.3.5 脂质体系中抗氧化能力的测定 由图9可知，金钱草多酚在试验浓度范围内的抑制率随着多酚浓度的增加而增加，维生素C的清除效果要比多酚的清除效果好，当多酚浓度为50 μg/L时，金钱草多酚对脂质体系抑制率为21.0%，而维生素C在此浓度下对脂质体系抑制率为75.0%；浓度为500 μg/L时，金钱草多酚对脂质体系中抑制率为75.2%，而维生素C在此浓度下对脂质体系中抑制率为99.2%。

3 结论