超声波辅助提取橘皮中黄酮类化合物工艺研究

张利文，王艳玲

（沈阳工业大学辽阳分校 石油化工学院，辽宁沈阳 111003）

橘子类水果是全世界产量最大的水果，也是一种重要的经济植物。皮渣作为其主要副产物，占柑橘总量的20%～40%，具有较大的利用价值[1]。柑橘皮中含有丰富的生物活性物质——黄酮类化合物，黄酮类药物具有抗脑缺血、抗心肌缺血、抗心律失常、镇痛、保肝护肝、抗病毒和抗肿瘤等作用[2]。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 材料

橘皮、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、NaOH、芦丁标准品、实验室用蒸馏水。

1.1.2 主要仪器

紫外可见分光光度计（上海第三分析仪器有限公司）、水浴锅（巩义市予华仪器有限责任公司）、三频超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）、粉碎机（顺德品科仕荣模具有限公司）、电子分析天平（沈阳龙腾电子有限公司）、循环水抽滤泵（陕西太康生物科技有限公司）、电热恒温鼓风干燥箱（上海市实验仪器总厂）。

1.2 实验方法

1.2.1 原料的预处理

将橘皮置于60 ℃的恒温干燥箱中干燥48 h，取出后用小型研磨机研磨，并且在80目筛上以得到干燥的橘皮粉末，备用。

1.2.2 标准曲线的绘制

1.2.2.1 芦丁标准品溶液的制备

称取0.015 g芦丁标准品置于烧杯中加热至60 ℃，并加入60%乙醇溶液，在超声波仪器中溶解后，将其转移到50.00 mL的容量瓶中，用60%乙醇水溶液稀释至刻度，摇匀，得到浓度为0.30 mg/mL的芦丁标准品溶液。

1.2.2.2 测定标准曲线

精密量取0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL和6.00 mL芦丁标准品溶液于25.00 mL容量瓶中，分别加入5%NaNO2溶液1.00 mL摇匀，静置6 min，再加入10%Al(NO3)3溶液1.00 mL，6 min后加入4%NaOH溶液1.00 mL，最后用60%的乙醇水溶液定容，20 min后开始测量吸光度值。用蒸馏水溶液为空白对照，在最大吸收波长510 nm处测量吸光度值，以浓度为横向坐标，吸光度值为纵坐标，绘制了芦丁的标准曲线。芦丁标准品浓度和吸光度的标准曲线如图1所示。

图1 芦丁标准品的吸光度

1.2.3 总黄酮的提取

称取1.00 g橘皮干粉，加入一定浓度的乙醇水溶液30 mL为提取剂，在一定温度下加热提取一定时间，抽滤，量取滤液体积，按照硝酸铝显色法配制溶液，测定吸光度值，计算在不同的乙醇浓度比条件总黄酮的提取得率。

1.2.4 总黄酮的测定

在25.00 mL容量瓶中加入一定量的类黄酮提取液，并加入1.00 mL 5% NaNO2的溶液摇晃，放置6 min，再加入1.00 mL 10% Al(NO3)3溶液，6 min后加入4% NaOH溶液1.00 mL，再用60%乙醇水溶液定容至刻度，摇晃，静置20 min，用紫外可见光光度计进行测量。

2 结果与分析

2.1 乙醇浓度对黄酮类化合物提取率的影响

称取1.00 g橘皮干粉5份，分别加入50%、60%、70%、80%和90%乙醇水溶液30 mL为提取剂，在60 ℃下加热提取20 min，抽滤，量取滤液体积，按照硝酸铝显色法配制溶液，测定吸光度值，计算在不同的乙醇浓度比条件总黄酮的提取得率。结果见表1。

表1 乙醇水溶液浓度对提取效果的影响

由表1可知，乙醇浓度由50%增加至90%时,总黄酮含量随之不断增加，但80%时增长比较缓慢，原因是乙醇浓度过低时，橘皮中黄酮化合物不能完全溶解到溶液中，并且随着乙醇浓度增大，溶解度增加，收率增加，但乙醇浓度太大时，黄酮被阻止进一步提取出来。因此选择80%乙醇水为最佳浓度。

2.2 提取温度对黄酮类化合物提取率的影响

称取1.00 g橘皮干粉5份，加入60%乙醇水溶液30 mL为提取剂，在40、50、60、70 ℃和80 ℃下分别加热提取20 min，抽滤，量取滤液体积，硝酸铝显色法配制溶液，测定吸光度值，计算在不同的温度条件下总黄酮的提取得率，结果见表2。

表2 温度对提取效果的影响

由表2可知，超声温度从40 ℃升高到80 ℃，橘皮中黄酮含量先增加后减少，在70 ℃时达到最大值。总黄酮含量减少的原因是当温度过高时，由于强烈的热效应而被破坏，有效成分被破坏，收率降低。因此，选择70 ℃为超声温度。

2.3 提取时间对黄酮类化合物提取率的影响

称取1.00 g橘皮干粉5份，加入60%乙醇水溶液30 mL为提取剂，在60 ℃下分别加热提取10、20、30、40 min和50 min，抽滤，量取滤液体积，按照硝酸铝显色法配制溶液，测定吸光度值，计算在不同时间条件下总黄酮的提取得率，结果见表3。

表3 加热时间对提取效果的影响

由表3可知，随着超声时间的延长，总黄酮含量先增加后减少。原因可能是超声时间短，类黄酮化合物不能完全溶解出来，所以产量低；随着超声时间的增加，黄酮全都溶解出来，收率增加；继续延长超声时间，超声波产生大量的热和空化效应，可能破坏了橘皮中黄酮的结构，最后得率降低。因此选择水浴加热时间40 min。

2.4 料液比对黄酮类化合物提取率的影响

称取1.00 g橘皮干粉5份，分别加入60%乙醇水溶液10、20、30、40 mL和50 mL为提取剂，在60 ℃下加热提取20 min，抽滤，量取滤液体积，按照硝酸铝显色法配制溶液，测定吸光度值，计算在不同的料液比条件下总黄酮的提取得率，结果见表4。

表4 料液比对提取效果的影响

表4表明，总黄酮含量随着料液比的升高而升高，但料液比在一定比例后，总黄酮含量也随之下降。原因可能是当料液比过小时，橘皮中黄酮类化合物不能完全溶解到于溶液中，所以得收率较低，随着料液比过大时，溶解度增加，得率增加，但料液比过大时，溶解在溶液中的黄酮浓度被稀释，收率反而降低。因此选择1∶30为最佳料液比。

2.5 正交试验

在上述单因素试验的基础上，进行四因素三水平的正交试验，确定乙醇浓度、料液比、超声时间、提取温度为研究因素，根据橘皮总黄酮收率，确定水浴加热辅助提取总黄酮的最佳提取条件，因素水平见表5。

表5 总黄酮提取L9（34）因素、水平设计

按照正交试验表操作，得数据如表6。

表6 正交试验结果

由表6可看出，R极差B＞D＞A＞C，即料液比对产率影响最大，其次是温度、乙醇浓度与提取时间。从K值大小可看出，正交试验最优水平为A2B3C3D3，即提取温度为75 ℃，乙醇浓度为80%、料液比为1∶35、提取时间为45 min。这个条件不在正交试验的9次试验中，为了确定试验的可靠性，必须在此条件下进行验证试验。

2.6 最佳工艺条件验证及结果

按照上述得出的最佳提取条件，对橘皮中黄酮提取液进行3次平行提取，测定提取物吸光度值，计算出平均得率，得率如表7所示。

表7 验证试验结果

由表7可知，3次平行提取试验的平均产收率为2.19%，正交试验表6中的最高的2.1%，说明该结果可靠。

3 结论

采用超声波提取技术来提取橘皮中总黄酮，以乙醇作为提取溶剂，通过单因素试验和正交试验考察了乙醇浓度、料液比、超声时间、超声温度等因素对橘皮中总黄酮提取率的影响。优化后的超声波辅助法提取橘皮总黄酮工艺参数为：提取温度75℃、乙醇浓度80%、料液比1∶35、提取时间为45 min，此条件下得率为2.19%。