多粘类芽孢杆菌的固态发酵工艺及其对水稻恶苗病的防治作用

刘珂欣，辛寒晓，范学明，刘丽英，孙中涛

(1. 山东农业大学生命科学学院，山东 泰安 271018；2. 山东佐田氏生物科技有限公司，山东 济南 250000)

我国是水稻种植大国，近年来水稻病害的发生严重影响了我国的水稻生产业[1]，其中，水稻恶苗病是最为严重的病害之一。水稻恶苗病是一种种传真菌性病害，发病面积广，造成的经济损失巨大，已成为影响水稻产量和品质的主要因素[2]。化学药剂浸泡稻种是防治水稻恶苗病的有效措施[3]，但长期使用化学药剂不仅导致水稻恶苗病菌产生抗药性，而且污染土壤和环境，危害人类健康，因此，高效、低毒、低残留的生物农药逐步代替高毒化学农药已成为必然趋势[4]。分离对水稻恶苗病菌具有拮抗作用的微生物并用于制备生防菌剂已成为研究热点。产祝龙等[5]研究发现，哈茨木霉对水稻恶苗病菌具有较强的拮抗作用。张淑梅等[6]从番茄叶中分离筛选出一株多粘类芽孢杆菌SD-6，对水稻恶苗病具有一定的防治作用。尚慧等[7]从云南省土壤中分离到一株放线菌(Actinomyces)YIM34165，可用于水稻恶苗病的防治。多粘类芽孢杆菌因能产生芽孢，抗逆性强，菌剂的生物稳定性高，应用效果好，是最具有应用价值的生防菌种[8]。但是目前多粘类芽孢杆菌的生产普遍存在菌数和芽孢生成率较低的问题，李玉洋等[9]对多粘类芽孢杆菌固态发酵工艺进行优化，虽然提高了菌数和芽孢生成率，但其选用菌糠作为主要发酵原料，存在不同来源的菌糠成分变化大、水分高、不易收集和贮存等问题，不具有普遍适用性。

本研究采用来源广泛、成分相对稳定、易于保存的麸皮为基础原料，通过对多粘类芽孢杆菌CH-23固态发酵工艺的系统优化，提高了活菌数和芽孢生成率，为多粘类芽孢杆菌生防菌剂的工业化生产提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌株 多粘类芽孢杆菌CH-23，由山东农业大学农业生物工程实验室筛选并保存。

1.1.2 试剂 玉米粉、麸皮、豆粕粉等，购自泰安市农贸市场；糖蜜，购自济南领航化工有限公司；蛋白胨、酵母粉，购自天津市英博生化试剂有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.1.3 培养基 斜面菌种培养采用营养琼脂培养基。三角瓶液体菌种培养基：蛋白胨1%，葡萄糖1%，NaH2PO4·2H2O 0.2%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH 7.2～7.4。固态发酵基础培养基：麸皮100%，料水比1∶1。

1.2 试验方法

1.2.1 最佳碳、氮源及无机盐的选择 在基础发酵培养基的基础上，分别添加不同浓度的玉米粉或15%(w/w)的葡萄糖、蔗糖、淀粉、糖蜜等碳源，在500 mL的三角瓶中进行固态发酵，装料量为25 g，种子液的接入量为10%(w/w)，33℃恒温培养，每隔12 h摇瓶一次，48 h发酵结束后，测定活菌数与芽孢生成率，以筛选最佳碳源。在此基础上，分别添加不同浓度的蛋白胨、1%(w/w)的酵母粉、豆粕粉或0.5%(w/w)的尿素、硫酸铵进行固态发酵，以筛选最佳氮源。碳源与氮源选定后，再分别添加不同浓度的硫酸锰、硫酸镁、磷酸氢二钾、硫酸锌等无机盐进行固态发酵，以优化无机盐的最佳添加量。所有试验均设3个平行，重复2次。

1.2.2 Plackett-Burman试验设计 在1.2.1单因素试验的基础上，采用 11因素的 Plackett-Burman 试验设计，考察碳源、氮源和无机盐对CH-23菌株活菌数与芽孢生成率的影响，以确定其显著因素，各因素及其水平见表 1。试验设计和数据分析均采用软件 Design Expert 8.0.6(Stat-Ease Corp., Minneapolis, MN, USA)。

1.2.3 Box-Behnken 试验设计 在Plackett-Burman试验的基础上，采用Box-Behnken中心组合设计对影响CH-23菌株活菌数与芽孢生成率的 3个显著性因素作进一步优化，试验因素与水平见表2。

表1 Plackett-Burman 试验因素和水平

表2 Box-Behnken 试验因素和水平

1.2.4 发酵条件优化 在培养基优化结果的基础上，采用单因素试验设计，分别在不同初始pH值、初始含水量、接种量和发酵温度等条件下进行发酵试验，以确定多粘类芽孢杆菌 CH-23的最佳发酵条件。试验均设3个平行，重复2次。

1.2.5 对水稻恶苗病的防治效果 盆栽试验在盆口内径、盆底内径和盆高分别为30、25 cm和30 cm的陶盆中进行。盆栽用土的全氮、全磷、全钾含量分别为1.07、2.31、5.57 g/kg，pH 6.52，电导率0.313 S/m。试验设4个处理，如表3所示，每个处理设3组平行，每组10盆，共120盆。每盆移栽长势均一的水稻秧苗5棵。试验所用多粘类芽孢杆菌CH-23菌剂为麸皮培养物，含菌量为2 × 1010cfu/g，水稻秧苗移栽前，将菌剂与盆栽土混合均匀。水稻恶苗病孢子悬液的浓度为1×107cfu/mL，其施入方式为秧苗移栽后喷施。多菌灵悬浊液为50%多菌灵可湿性粉剂的800倍稀释液，在水稻恶苗病孢子悬液喷施2天后进行喷施。按常规方式进行栽培管理，观察记录发病株数和相对病斑高度，并计算病级、病情指数和防治效果。病害分级标准见参考文献[10]，病级、病情指数及相对防效按下述公式计算[10]：

病级=(病斑高度/植株高度)× 9级；

病情指数=∑(各级发病水稻数 × 相应病情级别数)/(水稻总株数 × 最高病情级别数)× 100；

相对防效(%)=(CK2的病情指数 - CH-23处理的病情指数)/CK2的病情指数 × 100。

表3 盆栽试验设计

1.2.6 活菌数与芽孢率的测定 活菌数：采用平板菌落计数法[11]进行测定；芽孢率：80℃水浴15 min，杀死未产芽孢的细菌，然后采用平板菌落计数法测定芽孢数，并计算芽孢率。

2 结果与分析

2.1 不同碳、氮源以及无机盐对多粘类芽孢杆菌CH-23菌体生长与产孢率的影响

如表4所示，向麸皮培养基中补充5 种碳源均可提高活菌数和芽孢生成率，其中以添加15%玉米粉效果最佳，活菌数和芽孢生成率分别比对照提高了53.37%和26.38%。此结果与胡飞等[12]的研究结果一致，但在陆璇等[13]的研究中糯米粉是最佳附加碳源，这可能因为采用的菌株不同，其生理特性存在差异。补充5 种氮源均可提高CH-23 菌株的活菌数和芽孢生成率，且以1.5%的蛋白胨效果最好，与对照相比，活菌数和芽孢生成率分别提高68.75%和26.38%，此结果与俞坤辉[14]的研究结果相似，但在牛梦天[15]的研究中豆饼粉是最佳氮源，说明不同生产菌株，其最适氮源也存在差异。

表4 碳源与氮源对多粘类芽孢杆菌菌体生长和产孢率的影响

注：同列数据中，不同字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

如表5所示，添加无机盐对菌体生长和芽孢形成影响较大。与未添加无机盐的发酵培养基(对照)相比，添加硫酸镁、硫酸锰、硫酸锌、磷酸氢二钾均可促进菌体和芽孢生长，尤其是硫酸锰，当其用量为0.100%时，活菌数和芽孢率分别增加了21.84%和22.13%。

表5 无机盐对多粘类芽孢杆菌菌体生长和产孢率的影响

2.2 Plackett-Burman 试验结果

Plackett -Burman 试验结果如表6所示，采用Design Expert 8.0.6 软件对试验数据进行回归拟合，可得两个回归方程：

R1=3.220+0.350X1+0.012X2+0.058X3-0.110X4+0.360X5+0.520X6+0.200X7+0.032X8-0.440X9+0.010X10+0.060X11；

R2=57.400+6.050X1+2.220X2+1.840X3-0.500X4+2.660X5-0.880X6+3.330X7+0.0310X8-3.950X9+0.490X10+ 0.710X11。

式中：R1为活菌数(×1010cfu/g)；R2为芽孢生成率(%)；X1～X11为自变量的编码值。两个模型均极显著(P<0.01)，失拟项不显著(P>0.05)，相关系数分别为 0.991 4和0.992 8，表明其拟合度和可信度均很高。

表6 Plackett-Burman试验结果

模型系数的方差分析结果如表7所示。除硫酸锌(X4)和硫酸铵(X9)对活菌数和芽孢生成率、硫酸镁(X6)对芽孢生成率为负效应外，其他因素均为正效应。其中玉米粉(X1)、硫酸锰(X5)、蛋白胨(X7)对芽孢生成率的影响均达到了极显著水平(P<0.01)；豆粕粉(X2)和磷酸氢二钾(X3)对活菌数的影响不显著，但对芽孢生成率的影响达到了显著水平；硫酸镁(X6)对活菌数的影响极显著，但对芽孢生成率的影响不显著；酵母粉(X8)和尿素(X10)对活菌数和芽孢生成率的影响均未到达显著水平(P>0.05)。因此，从提高活菌数和芽孢生成率及节约成本的角度考虑，后续试验中，硫酸铵(X9)、豆粕粉(X2)、酵母粉(X8)和尿素(X10)不再添加，其余各因子均取其最优水平，即硫酸锌0.050%、硫酸镁0.15%、磷酸氢二钾0.10%，且玉米粉(X1)、硫酸锰(X5)、蛋白胨(X7)将采用响应面试验继续优化。

表7 Plackett-Burman试验方差分析结果

注：“*”表示在95%置信区间内显著；“**”表示在99%置信区间内显著。下同。

2.3 Box-Behnken试验结果

Box-Behnken试验设计及结果见表8，利用Design Expert 8.0.6 软件对试验数据进行回归拟合，获得两个二元多项回归方程：

式中：R1为活菌数(×1010cfu/g)；R2为芽孢生成率(%)；X1～X3为自变量的编码值。

对回归模型的方差分析结果如表9所示，两个回归模型均极显著(P<0.01)，失拟项均不显著(P>0.05)，相关系数分别为0.993 4和0.980 4，表明方程能够很好地对发酵过程进行描述及预测，拟合度和可信度均很高。一次项中，X1对活菌数和芽孢生成率的影响均不显著(P>0.05)，X2均极显著(P<0.01)，X3均显著(P<0.05)；交互项中，X1X3对活菌数和芽孢生成率的影响均极显著(P<0.01)，X2X3对活菌数影响不显著(P>0.05)，但对芽孢生成率影响显著(P<0.05)；二次项对活菌数和芽孢生成率的影响均极显著(P<0.01)。

显著性因素X2和X3对活菌数和芽孢生成率的影响如图1所示，抛物面开口向下，模型存在最大值。设定活菌数和芽孢生成率的权重相同，对回归方程组求极值，所得最佳点为玉米粉15.20%、蛋白胨1.59%、硫酸锰0.09%，所对应的最高活菌数和芽孢生成率分别为4.53×1010cfu/g和91.73%。为验证模型预测结果的准确性，在上述条件下进行了3次验证试验，活菌数和芽孢生成率的实测值分别为(4.39±0.56)× 1010cfu/g和(89.86±4.08)%，与预测值接近，说明该模型具有较好的预测性，所得最佳点有效。

表8 Box-Behnken试验结果

表9 Box- Behnken试验方差分析结果

2.4 培养条件对CH-23菌株生长与产孢的影响

如表10所示，初始含水量为55%时，活菌数和芽孢生成率最高，均与初始含水量为50%的处理差异显著(P<0.05)，与初始含水量60%的处理相比，活菌数差异不显著(P>0.05)，但芽孢生成率差异显著(P<0.05)。初始pH 6.0～8.0范围内，CH-23菌株均可大量生长，且在pH 7.5时活菌数和芽孢生成率最高。CH-23菌株的最适培养温度为33℃，此时活菌数和芽孢生成率均最高。随着接种量的增加(2%～10%)，活菌数和芽孢生成率均逐渐增大，接种量为10% 时，活菌数和芽孢生成率达到最高值。

图1 蛋白胨和硫酸锰对活菌数和芽孢生成率的影响

2.5 对水稻恶苗病的防治作用

水稻盆栽试验结果如表11所示。试验期间，CK1发病指数为零，CK2发病指数高达71.23%，说明试验采用的水稻恶苗病病菌悬液对受试水稻具有较强的致病性。与CK2相比，多粘类芽孢杆菌CH-23菌剂处理的发病指数仅为28.55%，平均相对防效高达68.35%，与多菌灵处理相比，防效差异不显著，说明多粘类芽孢杆菌CH-23菌剂对水稻恶苗病具有良好的防治效果。

表10 培养条件对多粘类芽孢杆菌CH-23生长与产孢的影响

注：同参数、同列数据中，不同字母表差异显著(P<0.05)。

表11 多粘类芽孢杆菌CH-23对水稻恶苗病的防治效果

注：表中数据为3次重复的平均值。不同小写字母表示差异显著(P< 0.05, Duncan 氏新复极差法)。

3 讨论与结论

农用微生物菌剂的生产有液态发酵和固态发酵两种方式，液态发酵因具有自动化程度高、发酵液活菌数高、芽孢生成率高等优势，成为主要的生产方式。但固态发酵也具有液态发酵不可比拟的优势，如生产用水少、排污少、能耗低、对原料适应性强、设备投资少等。随着能源和水资源成本的升高，环保压力的增大，固态发酵又重新受到重视。本研究以麸皮为基础原料，采用固态发酵方式生产多粘类芽孢杆菌菌剂，通过对发酵条件的系统优化，活菌数提高至4.39×1010cfu/g，是液体发酵平均水平的2倍，芽孢生成率提高至89.86%，达到了液体发酵的平均水平，具有进行大规模生产应用的可行性。

锰离子对多粘类芽孢杆菌等微生物的生长与芽孢形成具有重要影响。甄静等[16]。研究表明，添加0.5%的硫酸锰对多粘类芽孢杆菌的生长及芽孢的形成具有极大的促进作用。本研究硫酸锰的最适添加量为0.09%，其原因一方面是菌株差异，另一方面是培养基原料自身的锰离子含量存在差异。初始含水量不仅影响基质的水活度，还影响固态发酵过程中氧的传递和基质的膨胀程度等物理性质[16]。赵国群等[17]用梨渣和麸皮对多粘类芽孢杆菌进行固态发酵，初始含水率58.20%时菌数和芽孢生产率最高，本研究采用麸皮和玉米粉进行多粘类芽孢杆菌固态发酵，最适初始含水量为50%，说明培养基组成不同，其吸水和保水能力、疏松程度和透气情况等存在差异，即便培养同一种微生物，最佳初始含水量也会存在差异。多粘类芽孢杆菌CH-23菌剂对水稻恶苗病具有较好的生防效果，生防指数高达68.35%。但不同栽培时期相对防效不同，栽培前期防效较好，随着栽培期的延长防效有所下降。

总之，多粘类芽孢杆菌CH-23可采用来源广泛、成分相对稳定、易于保存的麸皮为基础原料，补充碳、氮源及无机盐，以固态发酵的方式进行生产，固态发酵工艺经系统优化后，活菌数和芽孢生成率大幅提高，达到了工业化生产要求。多粘类芽孢杆菌固态发酵菌剂对水稻恶苗病具有较好的防治效果，可用做生防菌剂。