台湾青枣果实过氧化物酶部分酶学特性分析

郑楚珊 詹嘉红

摘 要：过氧化物酶（POD）是参与酚类物质氧化，并且在果蔬酶促褐变中发挥着重要作用的主要酶类之一。该研究以台湾青枣果实为材料，以愈创木酚为底物，采用分光光度法对该果实POD部分酶学特性进行研究。结果表明，台湾青枣果实POD的最适pH值为5.8，最适温度为40℃。pH值小于3.0时酶基本失活，温度高于70℃时也基本失活。该酶热稳定性较差，100℃处理超过15s时，酶几乎钝化。抗坏血酸和NaHSO对POD有明显的抑制作用，而EDTA的抑制作用较弱。3种化合物的抑制效果依次是抗坏血酸>NaHSO3>EDTA。

关键词：台湾青枣；过氧化物酶；酶学特性

中图分类号 Q554 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）14-0025-04

Partial Characteristic of Peroxidase in Indian Jujube Fruits

Zheng Chushan1 et al.

（1Shantou No. 4 Middle School，Shantou 515041 China）

Abstract：Peroxidase（POD） is one of the major oxidases involving in the oxidation of phenolics and plays important roles in enzymatic browning of fruits and vegetables. With spectrophotometry method and based on substrate of guaiacol，the enzymatic characteristics of peroxidase（POD） from Indian jujube fruits were studied. Results showed that the optimum pH and temperature of POD were 5.8 and 40℃. At the pH value of less than 3.0 and the temperature higher than 70℃ were basically undetectable activity. The POD had poor thermal stability，its activity was completely passivated when it was incubated at 100℃ and dealing with more than 15s. Ascorbic acid and NaHSO3 had great inhabitation effect on POD，and EDTA was weaker. Their inhibitory capacity was decreased in the order：ascorbic acid>NaHSO3 >EDTA.

Key words：Indian jujube（Ziziphus mauritiana Lamk.）；Peroxidase；Enzymatic characteristic

臺湾青枣（Ziziphus mauritiana Lamk.），又称毛叶枣、印度枣、滇刺枣、西西果等，属鼠李科枣属植物[1]。台湾青枣是我国从台湾引进的热带亚热带特色水果，果实营养丰富，富含维生素、矿物质、膳食纤维及大量黄酮类化合物，尤其是VC含量，每100g台湾青枣果肉VC是苹果的56倍[2]，比号称“VC之王”的中华猕猴桃（47～255mg/100g）含量还高[3，4]，因而，有“热带小苹果”、“天然维生素丸”的美称。台湾青枣以其果大，核细，甜度适中，口味独特，并具有较高的药用价值和保健作用，如健脾强身、清凉解毒、镇静安神等功效[5]，越来越受到消费者的喜爱。但台湾青枣果实较不耐贮藏，鲜果在常温下极易失水皱缩、变黄、变褐和腐烂，严重影响其商品价值和食用品质[6]，其中，酶促褐变是台湾青枣品质下降的一个重要原因。

过氧化物酶（peroxidase，简称POD）是果蔬中普遍存在的一类氧化还原酶，是果蔬成熟和衰老的生理指标[7]，研究表明过氧化物酶参与了果蔬的酶促褐变[8-10]。近年来对台湾青枣果实采后保鲜研究多集中在生长调节剂[11，12]、涂膜[13]和CaCl2[14]处理等方面，而对其与褐变关系密切相关的过氧化物酶特性研究则鲜见报道。为此，本试验拟以台湾青枣果实为原料，对其过氧化物酶部分酶学性质进行研究，为了解台湾青枣果实采后褐变原因及制定防褐措施提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料 试验材料为无损伤、无病虫害、成熟度为70%～80%成的台湾青枣蜜枣品种，购自当地果场。

1.2 试剂及仪器 愈创木酚、30%过氧化氢、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸、抗坏血酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、亚硫酸氢钠等，以上试剂均为分析纯。UV2100型紫外可见分光光度计（尤尼柯（上海）仪器有限公司）；FA2004电子天平（上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂）；GL-16G-Ⅱ型高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；HH-2数显恒温水浴锅（江苏省金坛市友联仪器研究所）；PHS-2C型精密酸度计（上海雷磁仪器厂）等。

1.3 方法

1.3.1 POD的提取 称取台湾青枣果肉5g，加入10mL预冷0.05mol/L pH6.0磷酸盐缓冲液，低温研磨至匀浆，并定容至25ml后，低温离心（10000r/min，20min），上清液即为酶的粗提液，低温保存备用。

1.3.2 POD活性测定[15] 采用愈创木酚法，反应体系：0.05mol/L pH6.0磷酸缓冲液2.5mL+0.05mol/L愈创木酚1.5mL+1% H2O2 0.5mL+0.5mL酶液。于室温下测定波长470nm的OD值，对照以缓冲液代替酶液，结果以POD的相对酶活（%）表示。

1.3.3 POD最佳反应时间的确定 按1.3.2的测定方法，总反应体系分别反应0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5min，测其OD值。

1.3.4 POD最适pH的测定 用不同pH（范围2.2～8.0）磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液取代反应体系中的磷酸盐缓冲液，按1.3.2的测定方法，在室温下测定不同pH值下的OD值。

1.3.5 POD最适温度的测定 按1.3.2测定方法取样，在先不加酶液的情况下，最适pH缓冲液和反应底物分别在不同温度（10～70℃）条件下保温15min后，加入酶液继续在原温度下保温1min，于室温下测定不同温度条件下的OD值。

1.3.6 POD热稳定性的测定 取等量酶液若干份，置100℃水浴中加热处理，按一定时间间隔取出后，迅速冷却，按1.3.2的测定方法，于室温下测定不同热处理时间的OD值。

1.3.7 化合物对POD活性影响的测定 按1.3.2测定方法取样，向反应体系分别加入一定浓度的化合物，使化合物的最终浓度分别是：NaHSO3为0、5、10、15、20、25g/L；抗坏血酸为0、25、50、75、100、125mg/L；EDTA–2Na为0、3、6、9、12、15、18g/L，在最适温度、最适pH下测定不同浓度化合物的OD值。

2 结果与分析

2.1 POD的最佳反应时间 由图1可知，在酶促反应进程中，随着反应的进行，反应速率会逐渐降低，因随着反应时间的延长，底物浓度会减少、产物浓度会增加、酶活性会下降。因此为消除干扰因素，酶促反应速率是以初速率表示[16]。由图可知，在反应初期的前2min内，随着反应的进行，OD值几乎成直线上升，即在这一时间段，酶促反应速率基本保持不变。因此本实验确定的酶促反应时间以不超过2min为宜。

2.2 pH对POD活性的影响 环境pH值是影响酶活性的重要因素之一，每种酶只能在一定的pH范围内才表现出活性，而在这个范围内，酶活性常随着环境pH的改变而改变。由图2可知，该酶的最适pH值为5.8，pH值在5.0～7.4，酶均表现出较高活性，相对活性在80%以上。由于过酸或过碱的环境会使酶变性失活，当pH值从5.8降至4.2或升至8.0时，酶活性均迅速下降，相对残留活性降至46%，当pH低于3.0时，酶接近失活。因此，在台湾青枣的贮运保鲜或加工过程中，适当降低pH值可作为抑制褐变发生的有效措施，如通过添加食用酸等方法可一定程度抑制该酶的活性。

2.3 温度对POD活性的影响 温度对酶活性的影响具有双重性。在较低温度范围内，酶活性随着温度的升高而升高，但当温度超过最适温度后，随着温度的升高酶活性反而降低。温度对台湾青枣POD活性的影响如图3。由图3可知，该酶的最适温度为40℃，在25～50℃范围，该酶保持着较高活性，相对活性均在75%以上，而当温度为10℃时，POD相对活性仅有24.4%，当温度超过50℃时，随着温度的升高，酶活性迅速下降，当温度达到70℃时，酶基本失活。因此，对台湾青枣的保鲜防褐，鲜果可采用低温冷藏的方法来进行，而对加工食品则可通过适当的热处理来达到。

2.4 POD的热稳定性 由图4可知，在处理的前7s内，酶残留活性仍保持在80%以上，当处理时间超过7s后，酶活性迅速下降，处理时间达到13s时，残留活性不到20%，当处理时间超过15s时，酶活性几乎钝化。因此，台湾青枣的加工产品可通过瞬间高温处理来达到抑制褐变的目的。

2.5 化合物对POD活性的影响 由图5、图6和图7可知，3种化合物及其浓度对台湾青枣POD活性均有不同程度的抑制作用。当NaHSO3浓度在0～15g/L，随着浓度的增加，POD活性逐渐下降，当浓度超过15g/L时，酶活性降低更加明显，当浓度为25g/L时，酶活性受抑制程度达到94.6%。抗坏血酸浓度在0～50mg/L，随着浓度的增加，POD活性迅速下降，当抗坏血酸浓度为75mg/L时，残留活性仅为15%，当浓度升至125mg/L时，POD活性几乎被完全抑制。相比上面2种抑制剂，EDTA对POD活性抑制程度较低，当EDTA浓度在0～6.0g/L，随着浓度的增加，酶活性逐渐降低，但当EDTA浓度达到6.0g/L及以上时，酶活性基本趋于稳定，并一直保持在相对酶活60%左右。

根据上面试验结果，以较低抑制剂浓度呈现出最佳抑制效应分析，抗坏血酸的抑制效果最佳，其次是NaHSO3，EDTA抑制程度最低。

3 结论

实验结果显示：台湾青枣果实POD的最适pH值为5.8，当pH值在5.0～7.4，相对酶活保持在80%以上，当pH值低于3.0时，酶接近失活；台湾青枣果实POD的最适温度为40℃，低于20℃或高于50℃时，酶活性均明显下降；该酶热稳定性较差，当处理时间超过15s时，酶活性几乎钝化。

3种抑制剂对台湾青枣POD活性的抑制效果依次是：抗坏血酸>NaHSO3>EDTA。其中，抗坏血酸和NaHSO3对POD活性的抑制存在明显的剂量效应，当抗坏血酸浓度为125mg/L、NaHSO3浓度为25g/L时，台湾青枣果实POD活性几乎被完全抑制。考虑到食品的安全性，NaHSO3在食品中的添加应执行严格的限量。相比之下，抗坏血酸属天然抗氧化剂，安全性高、抑制效果好，因此，在实际应用中，可把抗坏血酸作为台湾青枣果实POD的理想抑制剂。

参考文献

[1]张义勇.台湾青枣、火龙果北方日光温室栽培技术[M].北京：中国农业出版社，2005：74-76.

[2]徐小艳，吴锦铸.台湾青枣的营养成分分析与利用[J].食品科技，2009，34（10）：32-34.

[3]任繼海.枣树管理与红枣储藏加工[M].北京：中国科学技术出版社，1998：58

[4]刘长明，王晓亮，陈美元.枣贮藏保鲜研究简述[J].烟台果树，2010，（3）：6-7.

[5]陈莲，林河通，陈艺晖，等.台湾青枣果实采后处理与保鲜技术研究进展[J].包装与食品机械，2010，28（2）：9-13，59.

[6]陈莲，林河通，王璐璐，等.安喜布处理对采后台湾青枣果实的保鲜效应[J].中国食品学报，2014，14（12）：113-120.

[7]丁薪源，曹健康.果蔬过氧化物酶酶学特性研究进展[J].食品科技，2012，（10）：62-66.

[8]白永亮，余铭，袁根良，等.大蕉后熟期的褐变相关性及褐变底物鉴定[J].食品科学，2012，33（04）：271-275.

[9]冯立娟，尹燕雷，杨雪梅，等.石榴果实发育期果皮褐变及相关酶活性变化[J]. 核农学报，2017，31（4）：0821-0827.

[10]康娟，庄尹宏，林碧英，等.丝瓜多酚氧化酶及过氧化物酶酶学特性的研究[J].福建农业学报，2017，32（8）：854-858.

[11]陈莲，王璐璐，林河通，等.1-MCP 延缓采后台湾青枣果实衰老及其与能量代谢的关系[J].热带作物学报，2017，38（1）：175-182.

[12]Bandopadhyay A，Sen S K. Studies on the Physicochemical Changes Associated with Storage Life of Bercv. Gola[J].Indian Agriculturist，1995，39：67-70.

[13]吉建邦，康效宁，谢辉.毛叶枣贮藏适性研究[J].食品工业科技，2003，24（10）：135-137.

[14]汪跃华，林银凤，温玉辉.氯化钙结合低温处理对台湾青枣贮藏的影响[J].西南农业大学学报（自然科学版），2006，28（2）：195-196，212.

[15]詹嘉红.杨桃果实过氧化物酶特性及其抑制条件研究[J].热带作物学报，2016，37（8）：1489-1493.

[16]王冬梅，吕淑霞.生物化学[M].北京：科学出版社，2010：95.

（責编：张宏民）