宁夏不同产地沙棘黄酮类物质含量及抗氧化活性的研究

杨岚 杨玲 李邦耀 李海明 杨宁宁 包慧 靳磊

摘 要：以寧夏6个不同产地的中国沙棘叶片为材料，对其黄酮类物质的最佳提取工艺和抗氧化活性进行研究。采用超声波法提取沙棘叶片中的黄酮类物质，采用比色法对不同产地沙棘叶片中黄酮的含量及其抗氧化活性（DPPH自由基、铜离子还原能力和金属鳌合能力）进行测定分析。结果表明：不同产地沙棘叶片中黄酮含量差异显著（P<0.05），其中含量最高的为隆德县六盘山的中国沙棘，达到了566.09mg/100g，而彭阳县中国沙棘叶片中黄酮类物质含量最低，仅为151.58mg/100g；不同产地中国沙棘叶片黄酮提取物均具有一定的抗氧化活性，隆德县神林乡地区沙棘黄酮提取物对DPPH自由基清除能力最强，固原市中国沙棘黄酮提取物的铜离子还原能力最强，而其金属离子鳌合能力最强的为隆德县六盘山中国沙棘；中国沙棘叶片黄酮提取物具有良好的抗氧化活性，可作为天然抗氧化剂用于食品和医药，具有良好的开发应用前景。与此同时，不同产地中国沙棘叶片黄酮的含量及其抗氧化活性均存在显著性差异，因此，在中国沙棘开发利用时对优良种源的筛选非常必要。

关键词：沙棘叶；总黄酮；提取工艺；抗氧化

中图分类号 S793 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）14-0022-04

Study on Flavonoid Content and Antioxidant Activity of Hippophae Rhamnoides from Different Areas in Ningxia

Yang Lan1 et al.

（Agriculture School of Ningxia University，Yinchuan 750021，China）

Abstract：With Hippophae rhamnoides L. subsp. sinensis leaves from 6 different producing areas in Ningxia as material，the project investigated the best extractive process and the antioxidant activity of the flavonoid substance. Ultrasonic method was adopted to extract the flavonoid substance in sea-buckthorn leaves，and colorimetric method was used to measure and analyze the content of flavonoid substance in sea-buckthorn leaves and the antioxidant activity （DPPH free radical，reduction capacity of cupric ion and metal-chelating capacity）. The content of the flavonoid substance in sea-buckthorn leaves of different producing areas has significant difference （P<0.05），among which the Chinese sea-buckthorn in Liupan Mountain of Longde County has the highest content of the flavonoid substance，reaching 566.09mg/100g，while the Chinese sea-buckthorn in Pengyang County has the lowest content of the flavonoid substance，reaching 151.58mg/100g. And the flavonoid substance in Chinese sea-buckthorn leaves from different producing areas have a certain antioxidant activity. The flavonoid extract in Chinese sea-buckthorn leaves in Shenlin District，Longde County has the strongest free radical scavenging capacity，the cupric ion in the flavonoid extract in Chinese sea-buckthorn leaves in Guyuan City has the strongest reduction capacity，while the flavonoid extract in Chinese sea-buckthorn leaves in Liupan Moutain of Longde County has the strongest metal-chelating capacity. The flavonoid extract in Chinese sea-buckthorn leaves has good antioxidant activity，therefore it can serve as natural antioxidant used in food and pharmaceutical industry. Furthermore，both the content of the flavonoid substance in Chinese sea-buckthorn leaves in different producing areas and the antioxidant activity have significant difference. Therefore，it is very necessary to screen excellent provenance in developing and utilizing Chinese sea-buckthorn.

Key words：Seabuckthorn leaves；Total flavonoids extraction process ；Antioxidant

中国沙棘（Hippophae rhamnoides L.subsp.sinensis）为胡颓子科（Elaeagnaceae）沙棘属（Hippophae）落叶性灌木，为药食同源植物。中国沙棘适应性强、生长快、耐干旱、抗风沙、保水土，还有很强的固氮能力，对生态起着很好的修复作用[1～2]。随着人们对合成抗氧化剂使用安全的质疑，寻找安全高效的天然抗氧化剂已成为食品添加剂的一个重要研究方向。而沙棘中含有丰富的黄酮类成分，以往对黄酮类物质提取的研究主要集中在果实和果渣中，而对黄酮含量更为丰富的沙棘叶研究却较少，但是沙棘叶资源丰富，一年四季均可采摘，干燥保存方便，加工提取技术相对简单，且用沙棘叶提取黄酮，不影响果实等的加工利用，具有更大的开发和应用的空间[3]。沙棘的根、茎、叶、花、果，含有丰富的营养物质和生物活性物质，可以广泛应用于食品、医药、轻工、航天、农牧渔业等国民经济的许多领域[4]。现代医学研究，沙棘可降低胆固醇，缓解心绞痛，还有防治冠状动脉粥样硬化性心脏病的作用[5]。而黄酮类化合物是1种广泛存在于植物中的刺激代谢产物，具有扩张血管、防御病原体、抗氧化、抗炎、抗癌、增加免疫力及调节细胞信号转导通路等多种生物活性[7]。本研究以宁夏不同产地的中国沙棘叶为材料进行黄酮类物质的最佳提取工艺以及抗氧化性能的研究，发掘沙棘潜在的生物保健功能，为沙棘资源在医药，食品及保健品行业的开发利用提供研究基础，也为发现高效、安全的天然抗氧化剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料的采集及处理

1.1.1 材料采集地点 中国沙棘叶片于2015年6月，采自宁夏西吉县、隆德县、海原县等地，具体信息见表1。

1.1.2 材料处理

1.1.2.1 沙棘叶粉碎过筛 将不同产地采集的中国沙棘叶片阴干、除杂后，粉碎，分别称取20.00g混合，用于黄酮含量及抗氧化活性的测定。

1.1.2.1 材料去脂 取沙棘粉末30g，加入150mL正己烷[8]，常温搅拌1h后真空抽滤，洗涤数次，至滤液无色，滤渣常温干燥。

1.2 试剂及仪器 福林–酚试剂购于北京奥博星生物技术有限责任公司；没食子酸、芦丁、儿茶素、新亚铜、菲洛嗪、DPPH自由基（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl）、水溶性维生素E（Trolox）购于美国Sigma公司。色谱甲纯、无水碳酸钠、氯化铝、亚硝酸钠、香草醛、盐酸、硫酸铜、醋酸钠，硫酸亚铁、双氧水、水杨酸、大豆卵磷脂、磷酸钠、氯化铁、抗坏血酸、羟甲苯丁酯、硫代巴比妥酸、氯仿、氯化亚铁购于天津博迪化工有限公司。

UV-4803型紫外可见光分光光度计：上海尤尼柯仪器有限公司；KDC-140HR低温冷冻离心机：安徽中科科学仪器有限公司；KQ-500DE型数控超声清洗器：昆山市超声仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 总黄酮含量测定

1.3.1.1 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品10mg，置于50mL容量瓶中，加入60%的乙醇适量，超声使其溶解，再加入60%的乙醇，稀释至刻度，摇匀，即得0.2mg/mL的芦丁标准品。

1.3.1.2 中国沙棘叶片中总黄酮含量的测定 对宁夏不同产地的中国沙棘叶片黄酮类物质含量进行测定，精密吸取沙棘提取液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL，分别置于25mL的容量瓶中，加60%乙醇至6mL，再加入5%亚硝酸钠溶液1.0mL，摇匀，放置6min，加10%的硝酸铝溶液1.0mL，摇匀，放置6min，加10%的氢氧化钠溶液10mL，加60%的乙醇至刻度，摇匀，放置10min。以相应的试剂作空白（即不加沙棘提取液，直接量取60%乙醇6mL按上述步骤进行试验），分光光度计于510nm波长下测定其吸光度[9]，然后带入回归方程得到提取液的黄酮质量浓度，进而得到沙棘叶中黄酮的含量，结果以mg/100g表示。得到回归方程：y=1.1555x+0.0105，R2=0.9996。式中：x为吸光度；y为样品浓度。黄酮含量的计算公式为：提取含量（mg/100g）=CV/m。式中：C为提取液的总黄酮质量浓度（mg/mL）；V为提取液的体积（mL）；m为称取实验材料的质量。

1.3.2 中国沙棘叶片中黄酮类物质抗氧化活性的测定

1.3.2.1 铜离子还原能力的测定（CUPRAC） 参考Apake等的方法，略有改动[10]。吸取0.1mL中國沙棘片叶黄酮提取液，依次加入硫酸铜（5mmol/L）、新铜试剂（3.75mmol/L）和醋酸铵（1mol/L，pH=7.0）缓冲液各1mL，最后加入1mL水，总反应体系为4.1mL，反应30min分光光度计于450nm比色，结果以每百克沙棘叶黄酮中所含的水溶性维生素E（Trolox）物质的量（μmol/100g）表示。

1.3.2.2 清除DPPH自由基活性的测定（HRSA） 参考Brand-Williams等的方法，略有改动[11]。精确称取12.50 mgDPPH溶于甲醇中，定容至100mL，其浓度为125mg/L，使用之前稀释5倍，现配现用。将0.1mL中国沙棘叶黄酮提取液加到3.9mL DPPH甲醇溶液中，避光反应30min，在分光光度计于515nm处测定其吸光值，对照以相同体积的甲醇代替样品，结果以每百克沙棘叶黄酮中所含的水溶性维生素E（Trolox）物质的量（μmol/100g）表示。

1.3.2.3 金属离子鳌合能力（MCC） 参考Dinis等的方法，略有改动[12]。取10mL试管，依次加入1mL中国沙棘叶片黄酮提取液、50μL氯化亚铁溶液（2mmol/L）、0.15mL菲洛嗪工作液（2.5mmol/L）和3.8mL的蒸馏水。反应10min后在562nm处测定其吸光值，结果以鳌合铁离子%表示。